فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR (TaqMan PCR دەپمۇ ئاتىلىدۇ ، تۆۋەندە FQ-PCR دەپمۇ ئاتىلىدۇ) 1995-يىلى ئامېرىكىدا PE (Perkin Elmer) تەتقىق قىلىپ ياساپ چىققان يېڭى يادرو كىسلاتا مىقدار تېخنىكىسى.ئەۋرىشىم PCR بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، FQ-PCR ئۇنىڭ مىقدار ئىقتىدارىنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن نۇرغۇن ئەۋزەللىككە ئىگە.بۇ ماقالە تېخنىكىنىڭ ئالاھىدىلىكى ، پرىنسىپى ، ئۇسۇلى ۋە قوللىنىلىشىنى قىسقىچە بايان قىلماقچى.
1 Features
FQ-PCR ئادەتتىكى PCR نىڭ سەزگۈرلۈكى يۇقىرى بولۇپلا قالماي ، يەنە فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ قوللىنىلىشى سەۋەبىدىن ، ئۇ ئېلېكتر ئېنېرگىيىسى ئۆتكۈزگۈچ سىستېمىسى ئارقىلىق PCR كېڭەيتىش جەريانىدا فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ ئۆزگىرىشىنى بىۋاسىتە بايقىيالايدۇ ، بۇ سان PCR نەتىجىسىنىڭ نۇرغۇن يېتەرسىزلىكلىرىنى يېڭىدۇ ، شۇڭا ئۇ يەنە DNA ئارىلاشتۇرۇشنىڭ يۇقىرى ئالاھىدىلىكى ۋە سپېكتروسكوپ تېخنىكىسىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقىغا ئىگە.
مەسىلەن ، ئادەتتىكى PCR مەھسۇلاتلىرىنى ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى ۋە ئۇلترا بىنەپشە نۇر بىلەن داغلانغان ئېتىدىئوم برومىد ياكى پولىئاكرىلامىد گېلى ئېلېكتروفورىسى ۋە كۈمۈش داغ بىلەن كۆزىتىش كېرەك.بۇ كۆپ خىل ئەسۋابلارنى تەلەپ قىلىپلا قالماي ، يەنە ۋاقىت ۋە كۈچ سەرپ قىلىدۇ.Ethidium bromide ئىشلىتىلگەن داغ ئادەم بەدىنىگە زىيانلىق ، بۇ مۇرەككەپ تەجرىبە تەرتىپلىرى بۇلغىنىش ۋە يالغان ئاكتىپلارنى پۇرسەت بىلەن تەمىنلەيدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، FQ-PCR ئەۋرىشكە قاچىلاش جەريانىدا پەقەت بىر قېتىم قاپاقنى ئېچىشقا موھتاج ، كېيىنكى جەريان پۈتۈنلەي يېپىق تۇرۇبا مەشغۇلاتى بولۇپ ، PCR دىن كېيىن پىششىقلاپ ئىشلەشنى تەلەپ قىلمايدۇ ، ئادەتتىكى PCR مەشغۇلاتىدىكى نۇرغۇن كەمچىلىكلەردىن ساقلىنىدۇ.بۇ تەجرىبىدە ئادەتتە PE شىركىتى تەتقىق قىلىپ ياساپ چىققان ABI7100 PCR ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىت ئىشلىتىلگەن.
بۇ ئەسۋابنىڭ تۆۋەندىكىدەك ئالاھىدىلىكلىرى بار: application كەڭ قوللىنىشچان پروگرامما: ئۇنى DNA ۋە RNA PCR مەھسۇلات مىقدارى ، گېن ئىپادىلەش تەتقىقاتى ، كېسەللىك قوزغاتقۇچنى بايقاش ۋە PCR شارائىتىنى ئەلالاشتۇرۇشقا ئىشلىتىشكە بولىدۇ.Unique ئۆزگىچە مىقدار پرىنسىپى: فلۇئورېسسېنسىيەلىك بەلگە قويۇلغان تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى ئىشلىتىپ ، لازېر ھاياجانلانغاندىن كېيىن PCR دەۋرىيلىكى بىلەن فلۇئورېسسېنسىيە مىقدارى يىغىلىدۇ ، شۇڭا مىقدارلاشتۇرۇش مەقسىتىگە يېتىدۇ.Work يۇقىرى خىزمەت ئۈنۈمى: 9600 PCR ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىت مىنىپ ياسالغان ، كومپيۇتېر 1 سائەتتىن 2 سائەتكىچە كونترول قىلىپ ، 96 ئەۋرىشكىنى ئاپتوماتىك ۋە ماس قەدەمدە كېڭەيتىش ۋە مىقدارلاشتۇرۇشنى تاماملايدۇ.Gel گېلى ئېلېكتروفورېزنىڭ ھاجىتى يوق: ئەۋرىشكىنى سۇيۇلدۇرۇش ۋە ئېلېكترو فوروزلاشنىڭ ھاجىتى يوق ، پەقەت ئالاھىدە تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئىشلىتىپ رېئاكسىيە نەيچىسىدە بىۋاسىتە بايقايسىز.The تۇرۇبا يولىدىكى بۇلغىنىش يوق: ئۆزگىچە تولۇق يېپىق رېئاكسىيە تۇرۇبىسى ۋە فوتو ئېلېكتر ئۆتكۈزۈش سىستېمىسى قوللىنىلدى ، شۇڭا بۇلغىنىشتىن ئەنسىرەشنىڭ ھاجىتى يوق.Results نەتىجىنى كۆپەيتىشكە بولىدۇ: مىقدارنىڭ ھەرىكەتچان دائىرىسى بەش چوڭلۇققا يېتىدۇ.شۇڭلاشقا ، بۇ تېخنىكا مۇۋەپپەقىيەتلىك تەرەققىي قىلدۇرۇلغاندىن بۇيان ، نۇرغۇنلىغان ئىلمىي تەتقىقاتچىلار تەرىپىدىن باھالىنىپ ، نۇرغۇن ساھەدە قوللىنىلدى.
2 پرىنسىپ ۋە ئۇسۇل
FQ-PCR نىڭ خىزمەت پىرىنسىپى بولسا Taq ئېنزىمنىڭ 5 ′ → 3 ′ exonuclease پائالىيىتىدىن پايدىلىنىپ ، PCR رېئاكسىيە سىستېمىسىغا فتورلۇق بەلگە قويۇلغان تەكشۈرۈش ئەسۋابى قوشۇش.تەكشۈرۈش ئەسۋابى دەسلەپكى تەرتىپتىكى DNA قېلىپىنى ئالاھىدە بىرلەشتۈرەلەيدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ 5′end ىگە فلۇئورېسسېنسىيە قويۇپ بېرىش گېنى FAM (6 كاربون ئوكسىد فلۇئورېسسىن ، فلۇئورېسسېنسىيە قويۇپ بېرىش يۇقىرى پەللىسى 518nm) دەپ يېزىلغان ، 3′end گە فلۇئورېسسېنسىيەنى ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسى TAMRA (6 كاربون ئوكسىدېترامېتىلروخومىن ، 6 فلوئورسېنسىيە قويۇپ بېرىش يۇقىرى پەللىسى) تەكشۈرۈلگەن.تەكشۈرۈش ئەسۋابى ساقلىنىپ قالغاندا ، ئۆڭكۈر گۇرۇپپىسى قويۇپ بېرىدىغان گۇرۇپپىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە قويۇپ بېرىشىنى باستۇرىدۇ.قويۇپ بېرىش گۇرۇپپىسى ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسىدىن ئايرىلغاندىن كېيىن ، چەكلەش كۈچى كۆتۈرۈلۈپ ، ئوپتىكىنىڭ زىچلىقى 518nm ئېشىپ ، فلۇئورېسسېنسىيەنى تەكشۈرۈش سىستېمىسى تەرىپىدىن بايقىلىدۇ. قايتا قۇرۇش باسقۇچىدا ، تەكشۈرۈش قېلىپى DNA بىلەن بىرىكىدۇ ، كېڭەيتىش باسقۇچىدىكى تاق فېرمېنتى دەسلەپكى قەدەمنىڭ كېڭىيىشى بىلەن DNA قېلىپىنى بويلاپ ھەرىكەت قىلىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئۈزۈلۈپ قالغاندا ، ئۆچۈرۈش ئۈنۈمى قويۇپ بېرىلىپ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى تارقىتىلىدۇ.ھەر قېتىم قېلىپ كۆچۈرۈلگەندە ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئۈزۈلۈپ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى تارقىتىلىدۇ.قويۇپ بېرىلگەن فتوروفورنىڭ سانى بىلەن PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ سانى ئوتتۇرىسىدا بىرمۇ-بىر مۇناسىۋەت بولغاچقا ، بۇ تېخنىكىنى قېلىپنى توغرا مىقدارلاشتۇرغىلى بولىدۇ.تەجرىبە ئەسۋابى ئادەتتە PE شىركىتى تەتقىق قىلىپ ياساپ چىققان ABI7100 PCR ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىتنى ئىشلىتىدۇ ، باشقا ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىتلىرىنىمۇ ئىشلىتىشكە بولىدۇ.ئەگەر تەجرىبە ئۈچۈن ABI7700 ئىنكاس تىپىدىكى ئىنكاس سىستېمىسى ئىشلىتىلسە ، ئىنكاس تاماملانغاندىن كېيىن ، كومپيۇتېر نەتىجىسىنى بىۋاسىتە تەھلىل قىلىش ئارقىلىق مىقدار نەتىجىسىنى بىۋاسىتە بەرگىلى بولىدۇ.ئەگەر سىز باشقا ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىتلىرىنى ئىشلەتسىڭىز ، فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئىشلىتىپ ، رېئاكسىيە تۇرۇبىسىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى بىرلا ۋاقىتتا ئۆلچەپ ، RQ + ، RQ- ، △ RQ نى ھېسابلىشىڭىز كېرەك.RQ + ئەۋرىشكە نەيچىسىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە قويۇپ بېرىش گۇرۇپپىسىنىڭ يورۇقلۇق دەرىجىسىنىڭ ئۆچۈرۈلۈش گۇرۇپپىسىنىڭ يورۇقلۇق دەرىجىسىنىڭ نىسبىتىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ، RQ- بۇ ئىككىسىنىڭ قۇرۇق تۇرۇبا نىسبىتىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ، △ RQ (△ RQ = RQ + -RQ-) سانلىق مەلۇمات بىر تەرەپ قىلىنغاندىن كېيىن ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ مىقدارىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ ئوتتۇرىغا چىقىشى سەۋەبىدىن ، سىناقنىڭ ئالاھىدىلىكى كۆرۈنەرلىك ئۆستى.تەكشۈرۈش لايىھىسى ئادەتتە تۆۋەندىكى شەرتلەرگە ماس كېلىشى كېرەك: binding تەكشۈرۈشنىڭ ئۇزۇنلۇقى 20-40 ئەتراپىدا بولۇشى ، باغلىنىشنىڭ كونكرېت بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىشى كېرەك.GC GC بازىسىنىڭ مەزمۇنى% 40 تىن% 60 كىچە بولۇپ ، يەككە يادرونىڭ تەكرارلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.Hy بىرىكتۈرۈشتىن ساقلىنىڭ.The تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن قېلىپ ئوتتۇرىسىدىكى باغلىنىشنىڭ مۇقىملىقى پىرىزما بىلەن قېلىپ ئوتتۇرىسىدىكى باغلىنىشنىڭ مۇقىملىقىدىن چوڭ ، شۇڭا تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ Tm قىممىتى دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ Tm قىممىتىدىن كەم دېگەندە 5 ° C يۇقىرى بولۇشى كېرەك.ئۇنىڭدىن باشقا ، تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ قويۇقلۇقى ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن قېلىپ تەرتىپى ئارىسىدىكى گومولوگىيە ۋە تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن دەسلەپكى ئارىلىقنىڭ ھەممىسى تەجرىبە نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:
جۇڭگو ھەقىقىي ۋاقىت PCR Easyᵀᴹ-Taqman ئىشلەپچىقارغۇچى ۋە تەمىنلىگۈچى |Foregene (foreivd.com)
يوللانغان ۋاقتى: 10-ئاينىڭ 15-كۈنىدىن 20-كۈنىگىچە
