• facebook
  • linkedin
  • youtube

QPCR تەجرىبىسىدە دەسلەپكى لايىھىلەشمۇ ئىنتايىن مۇھىم ئۇلىنىش.پىرىمېرلارنىڭ ماس كېلىدىغان ياكى ماس كەلمەيدىغانلىقى كۈچەيتمە ئۈنۈمنىڭ ئۆلچەمگە يەتكەن-يەتمىگەنلىكى ، كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتلارنىڭ كونكرېت ياكى ئەمەسلىكى ، تەجرىبە نەتىجىسىنىڭ بار-يوقلۇقى بىلەن زىچ مۇناسىۋەتلىك.
ئۇنداقتا qPCR نىڭ دەسلەپكى خاسلىقىنى قانداق قىلغاندا تېخىمۇ ياخشى قىلغىلى بولىدۇ؟يۇقىرى كۆتۈرۈش ئۈنۈمى يۇقىرىمۇ؟
بۈگۈن بىز سىزنى qPCR پىرىمېرلىرىنى بىرلىكتە لايىھىلەپ چىقىمىز ، ھەمدە qPCR دەسلەپكى لايىھىلەش تەجرىبىسىدىكى ئۈنۈملۈك ماھارەتكە ئايلىنىمىز.
QPCR پىرىسلىغۇچنى لايىھىلىگەندە ، ئادەتتە تۆۋەندىكى نۇقتىلارغا دىققەت قىلىڭ: دەسلەپكى قەدەمدە ئىمكانقەدەر ئىچكى قىسىمدا لايىھىلەش كېرەك ، مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى 100-300 bp ، Tm قىممىتى ئىمكانقەدەر 60 سېلسىيە گرادۇسقا يېتىشى ، يۇقىرى ئېقىن ۋە تۆۋەنكى ئېقىندىكى پىرىسلار ئىمكانقەدەر يېقىن بولۇشى ، باشلانغۇچنىڭ ئاخىرى G ياكى C بولۇشى كېرەك.
1. ئىچكى قىسىمنى ئۆز ئىچىگە ئالغان پىرىمېرلارنىڭ لايىھىلىنىشى
QPCR پىرىسلىغۇچ لايىھىلىگەندە ، ئىچكى قىسىمدا لايىھىلەنگەن پىرىمېرلارنى تاللاش gDNA قېلىپىنى كېڭەيتىشنىڭ ئالدىنى ئالالايدۇ ، مەھسۇلاتلارنىڭ ھەممىسى cDNA نىڭ كۈچەيتىلىشىدىن ھاسىل بولىدۇ ، شۇڭا gDNA نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ تەسىرىنى يوقىتىدۇ.
2. دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى
دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى ئادەتتە 18-30 nt ئارىلىقىدا ، كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقىنى ئىمكانقەدەر 100-300 bp ئارىلىقىدا كونترول قىلىش كېرەك.
ئەگەر قەغەز بەك قىسقا بولۇپ كەتسە ، ئۇ ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، بەك ئۇزۇن بولۇپ كەتسە ، ئاسانلا ئىككىلەمچى قۇرۇلما ھاسىل قىلىدۇ (مەسىلەن چاچ ياساش قۇرۇلمىسى).ئەگەر كۈچەيتمە مەھسۇلات بەك ئۇزۇن بولسا ، پولىمېرازانىڭ ئىنكاسىغا ماس كەلمەيدۇ ، بۇ PCR كېڭەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.
3. GC مەزمۇنى ۋە Tm قىممىتى
پىرىمېرلارنىڭ GC مەزمۇنىنى% 40 تىن% 60 كىچە كونترول قىلىش كېرەك.ئەگەر بەك يۇقىرى ياكى بەك تۆۋەن بولسا ، ئىنكاسنى قوزغىتىشقا پايدىسىز.ئوخشاش Tm قىممىتى ۋە تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىغا ئېرىشىش ئۈچۈن ئالدى ۋە تەتۈر يۆنىلىشلىك كۆرسەتكۈچنىڭ GC مەزمۇنى ئوخشاش بولۇشى كېرەك.
Tm قىممىتى ئىمكانقەدەر 55-65 سېلسىيە گرادۇس ئارىلىقىدا بولۇشى كېرەك ، ئادەتتە 60 سېلسىيە گرادۇس ئەتراپىدا بولۇشى كېرەك ، يۇقىرى ئېقىن ۋە تۆۋەن ئېقىننىڭ Tm قىممىتى ئىمكانقەدەر يېقىن بولۇشى ، ئەڭ ياخشىسى ° C 4 تىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك.
4. قەغەزنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى A نى تاللاشتىن ساقلىنىڭ
قەغەزنىڭ 3 ′ ئاخىرى ماس كەلمىسە ، ئوخشىمىغان ئاساسلارنىڭ بىرىكتۈرۈش ئۈنۈمىدە زور پەرقلەر بولىدۇ.ئاخىرقى ئاساسى A بولغاندا ، ئۇ ماسلاشمىغان ئەھۋالدىمۇ زەنجىرسىمان بىرىكتۈرۈشنى قوزغىتالايدۇ ، ئەڭ ئاخىرقى ئاساسى T بولغاندا ، ماس كەلمەسلىك ئۈنۈمى زور دەرىجىدە تۆۋەنلەيدۇ.شۇڭلاشقا ، دەسلەپكى 3 ′ ئاخىرىدىكى A نى تاللاشتىن ساقلىنىڭ ، T نى تاللىغان ياخشى.
ئەگەر ئۇ تەكشۈرۈش ئەسۋابى بولسا ، تەكشۈرۈشنىڭ 5 ′ ئاخىرى G بولالمايدۇ ، چۈنكى يەككە G بازىسى FAM فلۇئورېسسېنسىيە مۇخبىرلار توپىغا ئۇلانغان تەقدىردىمۇ ، G يەنە FAM گۇرۇپپىسى تارقاتقان فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى ئۆچۈرەلەيدۇ ، نەتىجىدە ساختا پاسسىپ نەتىجىلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.Appear.
5. بازا تەقسىملەش
پىرىماتوردىكى تۆت بازىنىڭ تارقىلىشى ئەڭ ياخشىسى تاسادىپىي بولۇپ ، 3 ′ ئاخىرىدا ئۇدا 3 G ياكى C دىن ئېشىپ كېتىدۇ ، ھەمدە ئۇدا 3 قېتىمدىن كۆپ ساقلىنىدۇ.G ياكى C GC مول تەرتىپلىك رايوندا جۈپلىشىش ئاسان.
6. دەسلەپكى لايىھىلەش رايونى مۇرەككەپ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلاردىن ساقلىنىشى كېرەك.
كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ يەككە تاللىشىدىن شەكىللەنگەن ئىككىلەمچى قۇرۇلما PCR نىڭ ئوڭۇشلۇق ئىلگىرىلىشىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.نىشان تەرتىپىدە ئىككىلەمچى قۇرۇلمىنىڭ بار-يوقلۇقىنى ئالدىن پەرەز قىلىش ئارقىلىق ، دەسلەپكى لايىھىلەشتە بۇ رايوندىن ساقلىنىشقا تىرىشىڭ.
7. پىرىمېرلارنىڭ ئۆزى ۋە پىرىمېرلار ئوتتۇرىسىدا ئۇدا بىر-بىرىنى تولۇقلايدىغان ئاساسلاردىن ساقلىنىشقا تىرىشىشى كېرەك.
پىرىمېرنىڭ ئۆزى بىلەن پىرىزما ئوتتۇرىسىدا ئۇدا 4 ئاساسى تولۇقلاش بولمايدۇ.قەغەزنىڭ ئۆزىدە قوشۇمچە تەرتىپ بولماسلىقى كېرەك ، بولمىسا ئۇ ئۆزىنى قاتلاپ چاچ ياساش قۇرۇلمىسىنى شەكىللەندۈرىدۇ ، بۇ قەغەز بىلەن قېلىپنىڭ تۇتاشتۇرۇلۇشىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ.
يۇقىرى ئېقىن بىلەن تۆۋەنكى ئېقىندىكى دەسلەپكى تەرتىپلەر ئارىسىدا قوشۇمچە تەرتىپلەر مەۋجۇت بولمايدۇ.پىرىمېرلار ئارىسىدىكى تولۇقلاش دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ ھاسىل قىلىدۇ ، بۇ PCR ئۈنۈمىنى تۆۋەنلىتىدۇ ، ھەتتا مىقدارنىڭ توغرىلىقىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئەگەر پىرىسلاش ۋە چاچ ياساش قۇرۇلمىسىدىن ساقلانغىلى بولمىسا ، △ G قىممىتى بەك يۇقىرى بولۇپ كەتمەسلىكى كېرەك (4.5 kcal / مولدىن تۆۋەن بولۇشى كېرەك).
8. پىرىمېرلار نىشاندىكى مەھسۇلاتنى كۈچەيتىدۇ.
QPCR بايقاشنىڭ ئاخىرقى مەقسىتى نىشان گېننىڭ كۆپلۈكىنى چۈشىنىش.ئەگەر ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىش كۆرۈلسە ، مىقدارلاشتۇرۇش توغرا بولمايدۇ.شۇڭلاشقا ، پىرىسلار لايىھەلەنگەندىن كېيىن ، ئۇلار BLAST تەرىپىدىن سىناق قىلىنىشى كېرەك ، مەھسۇلاتلارنىڭ ئالاھىدىلىكى تەرتىپلىك سانداندا سېلىشتۇرۇلىدۇ.
كېيىنكى قەدەمدە ، بىز ئىنسانلارنىڭ GAS6 (ئۆسۈشنى قولغا كەلتۈرۈش كونكرېت 6) گېنىنى qPCR دەسلەپكى لايىھەلىگۈچىلەرنى مىسالغا ئالىمىز.
01 سوئال گېنى
Homo GAS6NCBI ئارقىلىق.بۇ يەردە بىز گېن ئىسمى ۋە تۈرلىرىنى سېلىشتۇرۇشقا ئەھمىيەت بېرىپ ، ئۇلارنىڭ بىردەك بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىشىمىز كېرەك.
o102 گېن تەرتىپىنى تېپىڭ
(1) ئەگەر نىشان تەرتىپى گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA بولسا ، بىرىنجىسىنى تاللاڭ ، بۇ گېننىڭ گېن گۇرۇپپىسىنىڭ تەرتىپى.
o2(2) نىشان تەرتىپى mRNA بولسا ، ئىككىنچىسىنى تاللاڭ.كىرگەندىن كېيىن تۆۋەندىكى جەدۋەلدىكى «CDS» نى چېكىڭ.قوڭۇر تەگلىك تەرتىپى گېننىڭ كودلاش تەرتىپى.
o303 لايىھەلىگۈچىلەر
Primer-BLAST كۆرۈنمە يۈزىگە كىرىڭ
o4سول تەرەپ ئۈستىدىكى گېن تەرتىپ نومۇرى ياكى تەرتىپنى Fasta فورماتىغا كىرگۈزۈڭ ھەمدە مۇناسىۋەتلىك پارامېتىرلارنى تولدۇرۇڭ.
o5o6
«دەسلەپكى تاللاش» نى چېكىڭ ، NCBI ئېچىلىپ سىزگە بۇ خىل پارامېتىر تاللاشنىڭ باشقا قىستۇرما نۇسخىلىرىغا كېڭەيتىلىدىغانلىقىنى ئېيتىدۇ.ئوخشىمىغان قىستۇرما ۋارىيانتلارنى تەكشۈرۈپ ، مۇۋاپىق بولغان دەسلەپكى جۈپلەرگە ئېرىشىش ئۈچۈن يوللىيالايمىز (تۆۋەندىكى رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك).بۇ جەرياننى ئىجرا قىلىشقا ئون نەچچە سېكۇنت ۋاقىت كېتىشى مۇمكىن.
o7o8بۇ دەسلەپكى جۈپلەرنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ° C 60 ئەتراپىدا.تەجرىبىنىڭ مەقسىتىگە ئاساسەن ، ئوتتۇراھال ئۇزۇنلۇق ، ئېنىقلىق دەرىجىسى ۋە پىرىمېرلارنىڭ ئۆزىنى تولۇقلاش ئىقتىدارى تۆۋەن بولغان پىرىمېرلارنى تاللاڭ ، مۇۋەپپەقىيەت قازىنىش نىسبىتى بىر قەدەر يۇقىرى!
04 دەسلەپكى ئېنىقلىق دەلىللەش
ئەمەلىيەتتە ، Primer-Blast پىرىمېر لايىھىلەشتىن باشقا ، بىز ئۆزىمىز لايىھەلەپ چىققان پىرىمېرلارنىمۇ باھالايدۇ.دەسلەپكى لايىھىلەش بېتىگە قايتىڭ ، بىز لايىھىلىگەن يۇقىرى ئېقىن ۋە تۆۋەن ئېقىندىكى پىرىسلارنى كىرگۈزۈڭ ، باشقا پارامېتىرلار تەڭشەلمەيدۇ.تاپشۇرغاندىن كېيىن ، بۇ بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ باشقا گېنلاردىمۇ بار-يوقلۇقىنى كۆرەلەيسىز.ئەگەر ئۇلارنىڭ ھەممىسى بىز كۈچەيتمەكچى بولغان گېندا كۆرسىتىلسە ، بۇ بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ خاسلىقىنىڭ ناھايىتى ياخشى ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ!(مەسىلەن ، بۇ دەسلەپكى سوئالنىڭ بىردىنبىر نەتىجىسى!)
o9

05 دەسلەپكى سۈپەت ھۆكۈم
«مۇكەممەللەشتۈرۈش ئۈنۈمى ئۆلچەمگە يەتكۈزۈش» ، «كۈچەيتىلگەن مەھسۇلات ئالاھىدىلىكى» ۋە «ئىشەنچلىك تەجرىبە نەتىجىسى» بىرلەشتۈرۈلگەن «مۇكەممەل» پىرىمېر قايسى؟
o10كۈچەيتىش ئۈنۈمى

011ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى
پىرىمېرلارنىڭ كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمى% 90 -110 كە يېتىدۇ ، يەنى كۈچەيتىش ئۈنۈمى ياخشى ، ئېرىتىش ئەگرى سىزىقىنىڭ يەككە چوققىسى بار ، ئادەتتە Tm> 80 ° C بولىدۇ ، يەنى كۈچەيتىشنىڭ ياخشى ئىكەنلىكىدىن دېرەك بېرىدۇ.
 
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:
ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئاسان - SYBR GREEN I.
ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئاسان-تاقمان

 


يوللانغان ۋاقتى: 2-ئاينىڭ 10-كۈنىدىن 20-كۈنىگىچە