Ct قىممىتى فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR نىڭ ئەڭ مۇھىم نەتىجىنى كۆرسىتىش شەكلى.ئۇ گېن ئىپادىلەش پەرقىنى ياكى گېن كۆپەيتىش نومۇرىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلىدۇ.ئۇنداقتا فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدارنىڭ Ct قىممىتى مۇۋاپىق دەپ قارىلىدۇ؟Ct قىممىتىنىڭ ئۈنۈملۈك دائىرىسىگە قانداق كاپالەتلىك قىلىش كېرەك؟
Ct قىممىتى دېگەن نېمە؟
QPCR كېڭەيتىش جەريانىدا ، كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى بېكىتىلگەن فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسىغا يەتكەندە ، مۇناسىپ كۆپەيتىش دەۋرىيلىكى (دەۋرىيلىك بوسۇغىسى).C دەۋرىيلىك ، T بولسا Threshold نى كۆرسىتىدۇ.ئاددىي قىلىپ ئېيتقاندا ، Ct قىممىتى دەسلەپكى قېلىپنى كېڭەيتىش qPCR دىكى مەلۇم مەھسۇلاتقا يەتكەندە ماس كېلىدىغان دەۋرىيلىك سانى.ئاتالمىش «مەلۇم مىقداردىكى مەھسۇلات» كېيىنرەك چۈشەندۈرۈلىدۇ.
Ct قىممىتى نېمە قىلىدۇ؟
1. كۆرسەتكۈچ كېڭەيتىش ، قېلىپ مىقدارى ۋە Ct قىممىتى ئوتتۇرىسىدىكى مۇناسىۋەت
ئەڭ ياخشىسى ، qPCR دىكى گېنلار مەلۇم سان دەۋرىيلىكىدىن كېيىن تېز كېڭەيتىش ئارقىلىق توپلىنىدۇ.كۈچەيتمە دەۋرىيلىك سانى بىلەن مەھسۇلات مىقدارىنىڭ مۇناسىۋىتى: كۈچەيتىلگەن مەھسۇلات مىقدارى = دەسلەپكى قېلىپ مىقدارى × (1 + En) دەۋرىيلىك سانى.قانداقلا بولمىسۇن ، qPCR ئىنكاسى ھەمىشە كۆڭۈلدىكىدەك ئەھۋال ئەمەس.كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ مىقدارى «مەلۇم مەھسۇلات مىقدارى» غا يەتكەندە ، بۇ ۋاقىتتىكى دەۋرىيلىك سانى Ct قىممىتى بولۇپ ، ئۇ تېز كېڭەيتىش مەزگىلىدە.Ct قىممىتى بىلەن باشلىنىش قېلىپىنىڭ مۇناسىۋىتى: قېلىپنىڭ Ct قىممىتى بىلەن قېلىپنىڭ باشلىنىش كۆپەيتىلگەن نومۇرىنىڭ لوگارىزىم ئوتتۇرىسىدا تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋەت بار.دەسلەپكى قېلىپنىڭ قويۇقلۇقى قانچە يۇقىرى بولسا ، Ct قىممىتى شۇنچە كىچىك بولىدۇ.دەسلەپكى قېلىپنىڭ قويۇقلۇقى قانچە تۆۋەن بولسا ، Ct قىممىتى شۇنچە چوڭ بولىدۇ.
2. كېڭەيتىش ئەگرى سىزىقى ، فلۇئورېسسېنسىيە چېكى ۋە مەلۇم PCR مەھسۇلات مىقدارى
QPCR كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ مىقدارى بىۋاسىتە فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى ، يەنى كۈچەيتىش ئەگرى سىزىقى شەكلىدە ئوتتۇرىغا قويۇلغان.PCR نىڭ دەسلەپكى باسقۇچىدا ، كېڭەيتىش كۆڭۈلدىكىدەك شارائىتتا ، دەۋرىيلىك سانى ئاز ، مەھسۇلاتنىڭ توپلىنىشى ئاز ، فلۇئورېسسېنسىيە سەۋىيىسىنى فلۇئورېسسېنسىيە ئارقا كۆرۈنۈشىدىن ئېنىق پەرقلەندۈرگىلى بولمايدۇ.ئۇنىڭدىن كېيىن ، فلۇئورېسسېنسىيە كۆپىيىدۇ ۋە كۆرسەتكۈچ باسقۇچىغا كىرىدۇ.PCR ئىنكاسى پەقەت مەلۇم باسقۇچتا بايقالسا بولىدۇ ، PCR ئىنكاسى پەقەت ئاشكارلىنىش باسقۇچىدا تۇرغاندا ، ئۇنى «مەلۇم مىقداردىكى مەھسۇلات» قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، قېلىپنىڭ دەسلەپكى مەزمۇنىنى بۇنىڭدىن يەكۈنلەشكە بولىدۇ.شۇڭلاشقا ، مەلۇم مىقداردىكى مەھسۇلاتقا ماس كېلىدىغان فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ كۈچلۈكلۈكى فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسى.
PCR نىڭ ئاخىرقى باسقۇچىدا ، كېڭەيتىش ئەگرى سىزىقى ئەمدى كېڭەيتىلگەن كۈچەيتىشنى كۆرسەتمەيدۇ ، ھەمدە تۈز سىزىق ۋە ئېگىزلىك باسقۇچىغا كىرىدۇ.
3. Ct قىممىتىنىڭ قايتا ھاسىل بولۇشى
PCR دەۋرىيلىكى Ct قىممىتىنىڭ دەۋرىيلىك سانىغا يەتكەندە ، ئۇ ھەقىقىي كۆرسەتكۈچ كېڭەيتىش دەۋرىگە قەدەم قويدى.بۇ ۋاقىتتا ، كىچىك خاتالىق كۈچەيتىلمىدى ، شۇڭا Ct قىممىتىنىڭ كۆپىيىشچانلىقى ناھايىتى ياخشى ، يەنى ئوخشاش ۋاقىتتا ئوخشاش بولمىغان قېلىپ ئوخشىمىغان ۋاقىتتا ياكى ئوخشىمىغان تۇرۇبىلاردا كۈچەيتىلىدۇ.كۈچەيتىش ، ئېرىشكەن Ct قىممىتى تۇراقلىق.
1. كۈچەيتىش ئۈنۈمى En
PCR كۈچەيتىش ئۈنۈمى پولىمېرازانىڭ گېننى ئامپلونغا ئايلاندۇرىدىغان ئۈنۈمنى كۆرسىتىدۇ.بىر DNA مولېكۇلاسى ئىككى DNA مولېكۇلاسىغا ئايلانغاندا كۈچەيتىش ئۈنۈمى% 100 بولىدۇ.كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئادەتتە En دەپ ئىپادىلىنىدۇ.كېيىنكى ماقالىلەرنى تەھلىل قىلىشقا قۇلايلىق يارىتىش ئۈچۈن ، كېڭەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان ئامىللار قىسقىچە تونۇشتۇرۇلدى.
| تەسىر قىلىدىغان ئامىللار | چۈشەندۈرۈش | قانداق ھۆكۈم قىلىش كېرەك؟ |
| A. PCR چەكلىگۈچ | 1. قېلىپ DNA تەركىبىدە ئاقسىل ياكى يۇيۇش سۇيۇقلۇقى قاتارلىق PCR ئىنكاسىنى چەكلەيدىغان ماددىلار بار.2. تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى cDNA يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى RNA ياكى RT رېئاكتور زاپچاسلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بۇ بەلكىم كېيىنكى PCR ئىنكاسىنىمۇ چەكلىشى مۇمكىن. | 1. بۇلغىنىشنىڭ بار-يوقلۇقىغا A260 / A280 ۋە A260 / A230 ياكى RNA ئېلېكتروفورېز نىسبىتىنى ئۆلچەش ئارقىلىق ھۆكۈم قىلىشقا بولىدۇ.2. تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن cDNA مەلۇم نىسبەت بويىچە سۇيۇلدىمۇ يوق. |
| B. دەسلەپكى لايىھە لايىھىسى | پىرىمېرلار ئۈنۈملۈك باغلىمايدۇ | دەسلەپكى قەغەز ياكى چاچ پاسونى ، ماسلاشماسلىق ۋە بەزىدە ئىچكى لايىھەنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. |
| C. PCR ئىنكاسىنىڭ لايىھە لايىھىسى | 1. پىرىمېرلار ئۈنۈملۈك باغلىيالمايدۇ2. DNA پولىمېراسىنىڭ قويۇپ بېرىلىشى يېتەرلىك ئەمەس 3. ئۇزۇن مۇددەتلىك يۇقىرى تېمپېراتۇرا DNA پولىمېرا پائالىيىتى تۆۋەنلىدى | 1. تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى دەسلەپكى قىممەتنىڭ TM قىممىتىدىن يۇقىرى2. ئايرىشتىن بۇرۇنقى ۋاقىت بەك قىسقا 3. ئىنكاس باسقۇچىنىڭ ھەر بىر باسقۇچىنىڭ ۋاقتى بەك ئۇزۇن |
| D. رېئاكتور ياكى تۇرۇبا يولى خاتالىقىنى ئارىلاشتۇرۇش يېتەرلىك ئەمەس | رېئاكسىيە سىستېمىسىدا ، PCR رېئاكسىيە زاپچاسلىرىنىڭ يەرلىك قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى ياكى تەكشى ئەمەس ، نەتىجىدە PCR كۈچەيتكۈچنىڭ تەسىرسىز كۈچەيتىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. | |
| E. Amplicon ئۇزۇنلۇقى | ئامپلوننىڭ ئۇزۇنلۇقى بەك ئۇزۇن بولۇپ ، 300bp دىن ئېشىپ كېتىدۇ ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى تۆۋەن بولىدۇ | ئامپلوننىڭ ئۇزۇنلۇقى 80-300bp ئارىلىقىدا ئىكەنلىكىنى تەكشۈرۈڭ |
| F. qPCR رېئاكتورىنىڭ تەسىرى | رېئاكتوردىكى DNA پولىمېراسىنىڭ قويۇقلۇقى تۆۋەن ياكى بۇففېردىكى ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى ئەلالاشتۇرۇلمايدۇ ، نەتىجىدە تاق ئېنزىم پائالىيىتى ئەڭ يۇقىرى چەككە يەتمەيدۇ. | ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئارقىلىق كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى ئېنىقلاش |
2. Ct قىممىتى دائىرىسى
Ct قىممىتى 15-35 ئارىلىقىدا.ئەگەر Ct قىممىتى 15 دىن تۆۋەن بولسا ، كېڭەيتىش ئاساسىي ۋاقىت دائىرىسىدە بولۇپ ، فلۇئورېسسېنسىيە چېكىگە يەتمىگەن دەپ قارىلىدۇ.ئەڭ ياخشىسى ، Ct قىممىتى بىلەن قېلىپنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرىنىڭ لوگارىزىم ئوتتۇرىسىدا تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋەت بار ، يەنى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق.ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئارقىلىق ، كېڭەيتىش ئۈنۈمى% 100 بولغاندا ، گېننىڭ يەككە كۆپەيتىلگەن سانىنى ھېسابلاشتىكى ھېسابلانغان Ct قىممىتى 35 ئەتراپىدا بولىدۇ. ئەگەر 35 تىن يۇقىرى بولسا ، قېلىپنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرى نەزەرىيە جەھەتتىن 1 دىن تۆۋەن بولىدۇ ، بۇنى مەنىسىز دەپ قاراشقا بولىدۇ.
ئوخشىمىغان گېن Ct دائىرىسىگە نىسبەتەن ، دەسلەپكى نۇسخا مىقدارىدىكى گېن كۆپەيتىش نومۇرى ۋە كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئوخشىماسلىق سەۋەبىدىن ، گېن ئۈچۈن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلىپ ، گېننىڭ سىزىقلىق بايقاش دائىرىسىنى ھېسابلاشقا توغرا كېلىدۇ.
3. Ct قىممىتىدىكى تەسىر ئامىللىرى
كۈچەيتمە دەۋرىيلىك سانى بىلەن مەھسۇلات مىقدارى ئوتتۇرىسىدىكى مۇناسىۋەتتىن: كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ مىقدارى = دەسلەپكى قېلىپنىڭ مىقدارى × (1 + En) دەۋرىيلىك سانىدىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى ، كۆڭۈلدىكىدەك شارائىتتا ، دەسلەپكى قېلىپ ۋە En نىڭ Ct قىممىتىگە پاسسىپ تەسىر كۆرسىتىدۇ.قېلىپنىڭ سۈپىتى ياكى كۈچەيتىش ئۈنۈمىنىڭ پەرقى Ct قىممىتىنىڭ بەك چوڭ ياكى بەك كىچىك بولۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
4.Ct قىممىتى بەك چوڭ ياكى بەك كىچىك
يوللانغان ۋاقتى: 2-ئاينىڭ 22-كۈنىدىن 20-كۈنىگىچە
