• facebook
  • linkedin
  • youtube

RT-qPCR مولېكۇلا بىئولوگىيىسىنىڭ ئاساسلىق تەجرىبىسى ، كۆپچىلىك ئۇنىڭغا پىششىق بولۇشى كېرەك.ئۇ ئاساسلىقى RNA ئېلىش ، cDNA غا تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR دىن ئىبارەت ئۈچ باسقۇچنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.پايدىسى يوق ، نېمە ئىش بولۇۋاتىدۇ؟بەلكىم مەسىلە بار بولۇشى مۇمكىنتەتۈر كۆچۈرۈش تەجرىبىسى!قارىماققا تەتۈر كۆچۈرۈش تەجرىبىسى پەقەت RNA ، dNTP ، پىرىمېر ۋەتەتۈر كۆچۈرۈلگەنمەركەزدىن قاچۇرۇش نەيچىسىگە ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ ، ئەمما ئەمەلىي مەشغۇلات جەريانىدا ، يەنىلا دىققەت قىلىشقا تېگىشلىك نۇرغۇن تەپسىلاتلار بار.بۇ توغرىدا ئۆگەنەيلى!

RNA نىڭ سۈپىتىگە قانداق ھۆكۈم قىلىش كېرەك؟
CDNA غا ئېرىشىش ئۈچۈن ، RNA نىڭ سۈپىتى ئىنتايىن مۇھىم!RNA سۈپىتىنى ئاساسلىقى ئىككى تەرەپتىن بايقىغىلى بولىدۇ:
(1) RNA سەمىمىيىتى:ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى ئارقىلىق RNA پۈتۈنلۈكىنى تەكشۈرگىلى بولىدۇ. ئېۋكارىئوتنى مىسالغا ئالساق ، ئومۇمىي RNA نىڭ ئۈچ ئېنىق بەلۋاغ بار ، چوڭ-كىچىك مولېكۇلا ئېغىرلىقى 28S ، 18S ۋە 5S ، 28S بولسا 18S دىن ئىككى ھەسسە يورۇق.ئەگەر ئۈچ بەلۋاغنى كۆرگىلى بولسا ، ئەمما بەلۋاغ تىپى تۇتۇق ياكى Diffusion RNA نىڭ قىسمەن بۇزۇلغانلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ.بۇ ۋاقىتتا ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىنى دەرھال ئىجرا قىلىپ ، قېلىپ كىرگۈزۈشنى مۇۋاپىق كۆپەيتىڭ.ئەگەر كىچىك مولېكۇلا ئېغىرلىقى بار بەلۋاغنى كۆرگىلى بولمىسا ياكى RNA نى كۆرگىلى بولمىسا ، RNA پۈتۈنلەي بۇزۇلۇپ ، قايتا چىقىرىشقا توغرا كېلىدۇ.Agilent 2100 چوققا دىئاگرامما ۋە RIN قىممىتى بىلەن RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى كۆرسىتىدۇ.ئەگەر يادرو كىسلاتاسى مۇكەممەل بولسا ، ئېلېكترروگراممىنىڭ ئاساسى تەكشى بولىدۇ.ئەگەر يادرو كىسلاتاسى ئېغىر دەرىجىدە بۇزۇلسا ، ئاساسىي سىزىق تەكشى ئەمەس ، تېخىمۇ ناچارلىشىش چوققىلىرى كۆرۈلىدۇ.RIN نىڭ قىممىتى RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى ئەكس ئەتتۈرىدۇ ، 0-10 ئارىلىقىدا ، قىممىتى قانچە چوڭ بولسا ، RNA نىڭ سۈپىتى شۇنچە ياخشى بولىدۇ.ياخشى ، مۇكەممەللىك دەرىجىسى قانچە يۇقىرى بولسا.
(2) RNA نىڭ ساپلىقى:OD260 / 280 نىڭ نىسبىتىنى ئۇلترا بىنەپشە نۇر سپېكترى ئارقىلىق بايقىغىلى بولىدۇ.ئەگەر OD260 / 280 نىڭ نىسبىتى 1.9 دىن 2.1 ئارىلىقىدا بولسا ، ساپلىقى ناھايىتى ياخشى.
قالدۇق گېن DNA ئېنىق بولمىغان مىقدار نەتىجىسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ
RNA چىقىرىلغاندا ، بىز ئېرىشكەن RNA تازىلىنىپ باقمىغان گېن DNA (gDNA) بىلەن ئارىلاشتۇرۇلۇشى مۇمكىن.شۇڭلاشقا ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى cDNA مۇ ئارىلاشتۇرۇلىدۇgDNA.تۆۋەنكى ئېقىنداqPCRreaction,cDNAھەمدە gDNA بىرلا ۋاقىتتا كۈچەيتىلىشى مۇمكىن ، نەتىجىدە CT قىممىتى بىر قەدەر كىچىك بولىدۇ ، شۇڭا نەتىجىدە بىر تەرەپلىمىلىك بولۇشى مۇمكىن.
ئۇنداقتا بىز بۇ ئەھۋالدا نېمە قىلىشىمىز كېرەك؟Foregeneتەكلىپ بېرىدۇ:
(1) تەتۈر RNA غا گېن تازىلاش ئېلىپ بېرىش ، RNA ئېلىش جەريانىدا تۈۋرۈك ئېلىش ئارقىلىق ئېلىۋەتكىلى بولىدۇ.
(2) ئېلىنغان RNA نى DNase بىلەن داۋالاشI ، ئەمما ئۇنى EDTA بىلەن ئاخىرلاشتۇرۇڭ.
تەتۈر كۆچۈرۈلگەن رېئاكتورنىڭگېن تازىلاش مودۇلى بىلەن

تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈچۈن دەسلەپكى تاللاشنى قانداق تاللاش كېرەك؟
تەتۈر كۆچۈرۈلمە پىرىسلاشمۇ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىنىڭ نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.تەجرىبىنىڭ كونكرېت ئەھۋالىغا ئاساسەن تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈچۈن ئىختىيارى پىرىمېر ، Oligo dT ياكى گېنغا خاس دەسلەپكى تاللاشلارنى تاللىيالايسىز:
(1) كونكرېت خاتىرىلەر: گېنغا خاس پىرىمېرلار تەۋسىيە قىلىنىدۇ
(2) ئۇزۇن پارچە خاتىرىلەر: Oligo dT / گېنغا خاس پىرىمچىكلار تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
(3) ئۇزۇن بۆلەك خاتىرىسىنىڭ ئىچكى قىسمى.ئەگەر كېيىنكى qPCR تەجرىبىسى ئېلىپ بېرىلسا ، Oligo dT نى يالغۇز ئىشلىتىشكە بولمايدۇ ، چۈنكى Oligo dT نى ئىشلىتىشلا 3 ′ ئاخىرقى بىر تەرەپلىمە قاراشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىپ ، qPCR تەجرىبە نەتىجىسىنىڭ توغرا بولماسلىقىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
(4) miRNA: غول ئايلانما پىرىس ياكى قۇيرۇق پىرىسنى ئىشلىتىشكە بولىدۇ.

تەتۈر كۆچۈرۈلگەن مەھسۇلات cDNA نى قانچە قېتىم سۇيۇلدۇرۇش كېرەك؟
تەتۈر كۆچۈرۈلگەن مەھسۇلاتنىڭ cDNA غا ئېرىشكەندىن كېيىن ، qPCR تەجرىبىسى ئۈچۈن cDNA نى قانچە قېتىم سۇيۇلدۇرۇش كېرەك.ئەگەر cDNA نىڭ قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى ياكى بەك تۆۋەن بولسا ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى تەسىرگە ئۇچرىشى مۇمكىن.CDNA قويۇقلۇقىنى ئۆلچەشكە بولامدۇ ، قانداق قىلىش كېرەك؟
.بۇ ۋاقىتتا بەزى دوستلار دېيىشىدۇ ، ئاندىن مەن پاكلانغاندىن كېيىن قويۇقلۇقىنى ئۆلچەيمەن.بۇ يەردە ، Foregene ئەسكەرتىپ قويماقچى ، cDNA نى تازىلاش تەۋسىيە قىلىنمايدۇ ، چۈنكى بۇرۇلۇش ئارقىلىق ئېرىشكەن cDNA نىڭ ئۇزۇنلۇقى ئوخشىمايدۇ ، پاكلىنىشتا قىسقا CDNA يوقىلىدۇ.
(2) ئۇنداقتا قانداق قىلىش كېرەك؟QPCR تەجرىبىسىدىن ئىلگىرى ، cDNA نىڭ سۇيۇلۇش دەرىجىسىنى ئالدىن سىناق قىلىش ئارقىلىق بەلگىلىگىلى بولىدۇ.مەسىلەن: qDCR تەجرىبىسىنىڭ قېلىپى سۈپىتىدە cDNA پاي ھەل قىلىش چارىسى ، 10 ھەسسە سۇيۇلۇش ۋە 100 ھەسسە سۇيۇلۇشنى ئىشلىتىڭ ھەمدە 18-28 ئارىلىقىدا CT قىممىتى بار سۇيۇقلۇق ئامىلىنى تاللاڭ.

MiRNAs قانداق قىلىپ تەتۈر كۆچۈرۈلۈشى كېرەك؟
miRNA بولسا تاق يۆنىلىشلىك كىچىك مولېكۇلا RNA بولۇپ ، چوڭلۇقى تەخمىنەن 22 nt بولۇپ ، ئاقسىلغا ماس كەلمەيدۇ.ئۇزۇنلۇقى قىسقا بولغاچقا ، ئادەتتىكى qPCR ئۇسۇلىنى بىۋاسىتە مىقدارلاشتۇرۇش تەس ، شۇڭا دائىم miRNA نى كېڭەيتىشكە توغرا كېلىدۇ.miRNA ئۈچۈن كۆپ ئىشلىتىلىدىغان تەتۈر كۆچۈرۈش ئۇسۇللىرى غول ئايلانما ئۇسۇل ۋە قۇيرۇق ئۇسۇلىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.
غول ئايلانما ئۇسۇل غول ئايلانما پىرىسلاش ئارقىلىق miRNA نى كېڭەيتىش.بۇ بايقاش ئۇسۇلىنىڭ سەزگۈرلۈك ۋە ئېنىقلىق دەرىجىسى يۇقىرى ، ئەمما بايقاش ئۈنۈمى تۆۋەن.بىر تەتۈر ترانسكرىپسىيە پەقەت بىر miRNA ۋە ئىچكى پايدىلىنىشنىلا بايقىيالايدۇ.قۇيرۇق قوشۇش ئۇسۇلى ئىككىدىن تۈزۈلگەن بولۇپ ، ئۇ ئىككى خىل ئېنزىمنىڭ ئورتاق ھەرىكىتى ئارقىلىق تاماملىنىدۇ ، بۇلار PolyA پولىمېرازا ۋە تەتۈر كۆچۈرۈلگەن.PolyA پولىمېراسى ئۇزۇنلۇقىنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن miRNA غا PolyA قۇيرۇقىنى قوشۇشقا مەسئۇل بولىدۇ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش تەتۈر كۆچۈرۈش رېئاكسىيەسىنى قىلىدۇ.بۇ ئۇسۇلنىڭ بايقاش ئىقتىدارى يۇقىرى بولۇپ ، بىر تەتۈر ترانسكرىپسىيەدە كۆپ خىل miRNA ۋە ئىچكى پايدىلىنىشنى بايقىيالايدۇ ، ئەمما غول ئايلانما ئۇسۇلدا سەزگۈرلۈك ۋە خاسلىق تۆۋەن.


يوللانغان ۋاقتى: 2-ئاينىڭ 17-كۈنىدىن 20-كۈنىگىچە