RT-qPCR ئادەتتىكى PCR تېخنىكىسىدىن ياسالغان.ئۇ ئەنئەنىۋى PCR رېئاكسىيە سىستېمىسىغا فلۇئورېسسېنسىيەلىك خىمىيىلىك ماددىلار (فلۇئورېسسېنسىيە بوياقلىرى ياكى فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى) قوشىدۇ ، ھەمدە ئوخشىمىغان يورۇتۇش مېخانىزىمىغا ئاساسەن PCR ئۇلاش ۋە كېڭەيتىش جەريانىنى دەل ۋاقتىدا بايقىيالايدۇ.ئوتتۇراھالدىكى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ ئۆزگىرىشى PCR نىڭ ھەر بىر دەۋرىيلىكىدىكى مەھسۇلات ئۆزگىرىش مىقدارىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلىدۇ.ھازىر ئەڭ كۆپ قوللىنىلىدىغان ئۇسۇللار فلۇئورېسسېنسىيە بوياش ئۇسۇلى ۋە تەكشۈرۈش ئۇسۇلى.

فلۇئورېسسېنسىيە بوياش ئۇسۇلى:
SYBR Green Ⅰ ، PicoGreen ، BEBO قاتارلىق بىر قىسىم فلۇئورېسسېنسىيە بوياقلىرى ئۆزلۈكىدىن نۇر چىقارمايدۇ ، ئەمما dsDNA نىڭ كىچىك ئۆستەڭگە باغلانغاندىن كېيىن فلۇئورېسسېنسىيە تارقىتىدۇ.شۇڭلاشقا ، PCR ئىنكاسىنىڭ بېشىدا ، ماشىنا فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى بايقىيالمايدۇ.رېئاكسىيە ئۇلىنىشنى كېڭەيتىش (ئىككى باسقۇچلۇق ئۇسۇل) ياكى كېڭەيتىش باسقۇچى (ئۈچ باسقۇچلۇق ئۇسۇل) غا كەلگەندە ، بۇ ۋاقىتتا قوش سىزىق ئېچىلىدۇ ، يېڭى DNA پولىمېراسى تاياقچە بىرىكتۈرۈش جەريانىدا ، فتور فېرمېنسىيىسى مولېكۇلاسى dsDNA كىچىك ئۆستەڭدە بىرىكتۈرۈلۈپ ، فلۇئورېسسېنسىيە تارقىتىدۇ.PCR دەۋرىيلىكىنىڭ كۆپىيىشىگە ئەگىشىپ ، تېخىمۇ كۆپ بوياقلار dsDNA بىلەن بىرىكىدۇ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىمۇ ئۈزلۈكسىز كۈچىيىدۇ.SYBR Green نى مىسالغا ئالايلى.
تەكشۈرۈش ئۇسۇلى:
تاقمان تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان گىدرولىز تەكشۈرۈش ئەسۋابى.تەكشۈرۈشنىڭ 5 ′ ئۇچىدا فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى بار ، ئادەتتە FAM.تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ ئۆزى نىشان گېننى تولۇقلايدىغان تەرتىپ.فتوروفورنىڭ 3 ′ ئۇچىدا فلۇئورېسسېنسىيە ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسى بار.فلۇئورېسسېنسىيە رېزونانىس ئېنېرگىيىسىنى يۆتكەش (Förster رېزونانىس ئېنېرگىيىسى يۆتكەش ، FRET) پرىنسىپىغا ئاساسەن ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى (ئىئانە قىلغۇچى فلۇئورېسسېنسىيە مولېكۇلاسى) ۋە ئۆچۈرۈلگەن فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى (قوبۇل قىلغۇچى فلۇئورېسسېن مولېكۇلاسى) ھاياجانلىنىش سپېكترى بىر-بىرىگە ئۇلىنىپ ، ئارىلىقى ئىنتايىن يېقىن بولغاندا (7-10nm) ، ئىئانە قىلغۇچى مولېكۇلانىڭ ھاياجانلىنىشى قوبۇل قىلغۇچى مولېكۇلانىڭ فلۇئورېسسېنسىيەسىنى قوزغىتالايدۇ.شۇڭلاشقا ، PCR ئىنكاسىنىڭ دەسلىپىدە ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى ھەقسىز ۋە سىستېمىدا مۇكەممەل بولغاندا ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى فلۇئورېسسېنسىيە چىقارمايدۇ.ئۇلىغاندا ، قەغەز ۋە تەكشۈرۈش ئەسۋابى قېلىپقا باغلىنىدۇ.كېڭەيتىش باسقۇچىدا ، پولىمېرازا يېڭى زەنجىرنى ئۇدا بىرىكتۈردى.DNA پولىمېرازانىڭ 5′-3 ′ ئېكولوگىيىلىك پائالىيىتى بار.تەكشۈرۈش ئەسۋابىغا يەتكەندە ، DNA پولىمېراسى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى قېلىپتىن ھىدرولىزلايدۇ ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسىنى ئۆچۈرگۈچى فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسىدىن ئايرىپ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى تارقىتىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن قېلىپ ئوتتۇرىسىدا بىرمۇ-بىر مۇناسىۋەت بولغاچقا ، تەكشۈرۈشنىڭ توغرىلىقى ۋە سەزگۈرلۈكى جەھەتتە تەكشۈرۈش ئۇسۇلى بوياش ئۇسۇلىدىن ئەۋزەل.

رەسىم 1 qRT-PCR نىڭ پرىنسىپى

دەسلەپكى لايىھە
پرىنسىپلار:

پىرىمچىكلار يادرو كىسلاتاسى تۈرىدىكى ساقلانغان رايوندا لايىھىلىنىشى ھەمدە خاسلىقى بولۇشى كېرەك.

ئەڭ ياخشىسى cDNA تەرتىپىنى ئىشلىتىش ، mRNA تەرتىپىنىمۇ قوبۇل قىلىشقا بولىدۇ.ئەگەر ئۇنداق بولمىسا ، DNA تەرتىپىنىڭ cds رايون لايىھىسىنى تېپىپ چىقىڭ.
فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى 80-150bp ، ئەڭ ئۇزۇنسى 300bp ، دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى ئادەتتە 17-25 ئاساسى ئارىلىقىدا ، يۇقىرى ئېقىن بىلەن تۆۋەنكى ئېقىننىڭ پەرقى بەك چوڭ بولۇپ كەتمەسلىكى كېرەك.

G + C مەزمۇنى% 40 تىن% 60 كىچە ،% 45-55% ئەڭ ياخشى.
TM قىممىتى 58-62 گرادۇس ئارىلىقىدا.
دەسلەپكى ئۆلچەش ئۆلچىمى ۋە ئۆز-ئۆزىنى ئۆلچەشتىن ساقلىنىشقا تىرىشىڭ ، (ئۇدا 4 جۈپتىن ئارتۇق تولۇقلاش ئاساسى كۆرۈنمەيدۇ) چاچ ياساش قۇرۇلمىسى ، ئەگەر ساقلانغىلى بولمىسا ، ΔG <4.5kJ / mol * نى ياساپ چىقىڭ
كونكېرت كۈچەيتىلگەن تەرتىپنىڭ گومولوگىيىسى ئەڭ ياخشىسى% 70 كىمۇ يەتمەيدۇ ياكى 8 تولۇقلىما ئاساسى گومولوگىيەگە ئىگە.
ساندان:
ئاچقۇچلۇق سۆزلەر ئارقىلىق CottonFGD ئىزدەش
دەسلەپكى لايىھە:
IDT-qPCR دەسلەپكى لايىھىلەش

Fig2 IDT تور دەسلەپكى لايىھىلەش قورال بېتى

رەسىم 3 نەتىجە بېتى كۆرسىتىش
LncRNA دەسلەپكى لايىھەلىگۈچى:
lncRNA:mRNA غا ئوخشاش قەدەم باسقۇچلار.
miRNA:غول ئايلانما ئۇسۇلنىڭ پرىنسىپى: بارلىق miRNA لار تەخمىنەن 23 nt ئەتراپىدا قىسقا تەرتىپ بولغاچقا ، بىۋاسىتە PCR بايقاشنى ئەمەلگە ئاشۇرغىلى بولمايدۇ ، شۇڭا غول ئايلانما تەرتىپ قورالى ئىشلىتىلىدۇ.غول ئايلانما تەرتىپ تەخمىنەن 50 nt لىك تاق لىنىيىلىك DNA بولۇپ ، ئۇ ئۆزى چاچ ياساش قۇرۇلمىسىنى ھاسىل قىلالايدۇ.3 'ئاخىرىنى miRNA قىسمەن پارچىسىنىڭ تولۇقلىغۇچىسى قىلىپ لايىھىلەشكە بولىدۇ ، ئاندىن نىشان miRNA تەتۈر كۆچۈرۈلۈش جەريانىدا غول ئايلانما تەرتىپكە ئۇلىنالايدۇ ، ئومۇمىي ئۇزۇنلۇقى 70bp غا يېتىدۇ ، بۇ qPCR تەرىپىدىن بېكىتىلگەن كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقىغا ماس كېلىدۇ.قۇيرۇق miRNA دەسلەپكى لايىھە.
كۈچەيتمە خاراكتېرلىك بايقاش:
توردا پارتلاش سانلىق مەلۇمات ئامبىرى: تەرتىپلىك ئوخشاشلىق بىلەن CottonFGD پارتىلاش
يەرلىك پارتلاش: Blast + نى ئىشلىتىپ يەرلىك پارتلاش ، linux ۋە macos بىۋاسىتە يەرلىك ساندان قۇرالايدۇ ، win10 سىستېمىسىنى ubuntu bash نى ئورناتقاندىن كېيىنمۇ قىلغىلى بولىدۇ.يەرلىك پارتلاش سانلىق مەلۇمات ئامبىرى ۋە يەرلىك پارتلاش;win10 دا ubuntu bash نى ئېچىڭ.
ئەسكەرتىش: ئېگىزلىكتىكى پاختا ۋە دېڭىز ئارىلىدىكى پاختا تېتروپلوئىد زىرائەتلەر ، شۇڭا پارتىلاشنىڭ نەتىجىسى دائىم ئىككى ياكى ئۇنىڭدىن كۆپ بولىدۇ.ئىلگىرى ، NAU cds نى ساندان قىلىپ ئىشلىتىپ پارتىلاشنى ئەمەلگە ئاشۇرغىلى بولىدۇ ، پەقەت SNP پەرقى بار ئىككى خىل گومولوگىيىلىك گېننى تېپىشى مۇمكىن.ئادەتتە ، ئىككى خىل گومولوگىيىلىك گېننى دەسلەپكى لايىھە ئارقىلىق ئايرىغىلى بولمايدۇ ، شۇڭا ئۇلار ئوخشاش مۇئامىلە قىلىنىدۇ.ئەگەر روشەن ئىندېل بولسا ، پىرىسلاش ئادەتتە ئىندېل ئۈستىدە لايىھىلەنگەن ، ئەمما بۇ پىرىمېرنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن ئەركىن ئېنېرگىيە تېخىمۇ يۇقىرى كۆتۈرۈلۈپ ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى تۆۋەنلەيدۇ ، ئەمما بۇ ساقلانغىلى بولمايدۇ.

دەسلەپكى ئىككىلەمچى قۇرۇلمىنى بايقاش:
باسقۇچ:ئېچىۋېتىلگەن oligo 7 → كىرگۈزۈش قېلىپى تەرتىپى → تارماق كۆزنەكنى تاقاش → ساقلاش → قېلىپنى دەسلەپكى قەدەمدە تېپىش ، ctrl + D نى بېسىپ دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقنى تەڭشەش → ئۆزلۈكىدىن ئۆلچەش گەۋدىسى ، گېرودېرمېر ، چاچ پاسونى ، ماسلاشماسلىق قاتارلىق ھەر خىل ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلارنى تەھلىل قىلىڭ.ئالدى پرېسلاشنىڭ نەتىجىسى ياخشى ، روشەن دىمېر ۋە چاچ پاسونى قۇرۇلمىسى يوق ، ئۈزلۈكسىز تولۇقلاش ئاساسى يوق ، ئەركىن ئېنېرگىيەنىڭ مۇتلەق قىممىتى 4.5 دىن تۆۋەن ، ئارقا پرېسلاش ئۇدا 6 بازىنى تولۇقلايدۇ ، ئەركىن ئېنېرگىيە 8.8 ؛بۇنىڭدىن باشقا ، 3 ′ ئۇچىدا تېخىمۇ ئېغىر بولغان ۋاقىت سىزىقى كۆرۈلىدۇ ، ئۇدا 4 بازىنىڭ سىزىقچىسى پەيدا بولىدۇ.گەرچە ئەركىن ئېنېرگىيە يۇقىرى بولمىسىمۇ ، 3 ′ dimer Chl كۈچەيتكۈچنىڭ ئالاھىدىلىكى ۋە كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە ئېغىر تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، چاچ پاسونى ، گېرودېرومېتىر ۋە ماسلاشماسلىقنى تەكشۈرۈش كېرەك.

Fig3 oligo7 بايقاش نەتىجىسى
كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى بايقاش:
PCR ئىنكاسىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى PCR نەتىجىسىگە ئېغىر تەسىر كۆرسىتىدۇ.QRT-PCR دە ، مىقدارلاشتۇرۇش نەتىجىسى ئۈچۈن كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئالاھىدە مۇھىم.رېئاكسىيە بۇففېردىكى باشقا ماددىلار ، ماشىنا ۋە كېلىشىملەرنى ئېلىۋېتىڭ.پىرىمېرلارنىڭ سۈپىتىمۇ qRT-PCR نىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ.نەتىجىنىڭ توغرىلىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ھەم نىسپىي فلۇئورېسسېنسىيە مىقدارى ۋە مۇتلەق فلۇئورېسسېنسىيە مىقدارىنى ئۆلچەش ئەسۋابىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى بايقاشقا موھتاج.ئۈنۈملۈك qRT-PCR كېڭەيتىش ئۈنۈمىنىڭ% 85 تىن% 115 كىچە ئىكەنلىكى ئېتىراپ قىلىنغان.ئىككى خىل ئۇسۇل بار:
1. ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئۇسۇلى:
a.CDNA نى ئارىلاشتۇرۇڭ
b.Gradient dilution
c.qPCR
d.كېڭەيتىش ئۈنۈمىنى ھېسابلاش ئۈچۈن تۈز سىزىقلىق تەڭلىمىسى
2. LinRegPCR
LinRegPCR بولسا ھەقىقىي ۋاقىتتىكى RT-PCR سانلىق مەلۇماتلىرىنى ئانالىز قىلىدىغان پروگرامما بولۇپ ، SYBR يېشىل ياكى شۇنىڭغا ئوخشاش خىمىيىلىك ئاساس قىلىنغان مىقدارلاشقان PCR (qPCR) سانلىق مەلۇمات دەپمۇ ئاتىلىدۇ.بۇ پروگرامما ئاساسىي بولمىغان تۈزىتىلگەن سانلىق مەلۇماتلارنى ئىشلىتىدۇ ، ھەر بىر ئەۋرىشكەدە ئاساسىي جەھەتتىن تۈزىتىش ئېلىپ بارىدۇ ، كۆزنەكنىڭ سىزىقلىق سىزىقىنى بەلگىلەيدۇ ، ئاندىن سىزىقلىق كەينىگە قايتىش ئانالىزى ئارقىلىق PCR سانلىق مەلۇمات توپلىمى ئارقىلىق تۈز سىزىققا ماس كېلىدۇ.بۇ قۇرنىڭ يانتۇلۇقتىن ھەر بىر يەككە ئەۋرىشكىنىڭ PCR ئۈنۈمى ھېسابلىنىدۇ.ئامپلوننىڭ ئوتتۇرىچە PCR ئۈنۈمى ۋە ھەر بىر ئەۋرىشكەنىڭ Ct قىممىتى ئىختىيارى فلۇئورېسسېنسىيە بىرلىكىدە ئىپادىلەنگەن ھەر بىر ئەۋرىشكىنىڭ باشلىنىش قويۇقلۇقىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلىدۇ.سانلىق مەلۇمات كىرگۈزۈش ۋە چىقىرىش Excel ئېلېكترونلۇق جەدۋىلى ئارقىلىق بولىدۇ.پەقەت ئەۋرىشكە
ئارىلاشتۇرۇش تەلەپ قىلىنىدۇ ، تەدرىجىي بولمايدۇ
باسقۇچلار تەلەپ قىلىنىدۇ:(Bole CFX96 نى مىسالغا ئالايلى ، ئېنىق ABI بار ماشىنا ئەمەس)
تەجرىبە:بۇ ئۆلچەملىك qPCR تەجرىبىسى.
qPCR سانلىق مەلۇمات چىقىرىش:LinRegPCR ئىككى خىل چىقىرىش ھۆججىتىنى تونۇيالايدۇ: RDML ياكى مىقدارلاشتۇرۇش كۈچەيتىش نەتىجىسى.ئەمەلىيەتتە ، ئۇ ماشىنا ئارقىلىق دەۋرىيلىك سان ۋە فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ ھەقىقىي بايقاش قىممىتى بولۇپ ، كۈچەيتمە سىزىقلىق بۆلەك ئۈنۈمىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە ئۆزگىرىش قىممىتىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق قولغا كېلىدۇ.
سانلىق مەلۇمات تاللاش: نەزەرىيە جەھەتتىن ، RDML قىممىتى ئىشلىتىشكە بولىدۇ.كومپيۇتېرىمنىڭ مەسىلىسى يۇمشاق دېتالنىڭ RDML نى تونۇپ يېتەلمەيدىغانلىقى ، شۇڭا مېنىڭ ئەسلى سانلىق مەلۇمات بولۇش سۈپىتىم بىلەن مۇنەۋۋەر چىقىرىش قىممىتىگە ئىگە ئىكەنلىكىم مۆلچەرلەندى.ئالدى بىلەن سانلىق مەلۇماتلارنى قوپال تەكشۈرۈش ئېلىپ بېرىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ ، مەسىلەن ئەۋرىشكە قوشماسلىق قاتارلىقلار. بۇ سانلىق مەلۇماتلارنى چىقىرىش سانلىق مەلۇماتلىرىدا ئۆچۈرگىلى بولىدۇ (ئەلۋەتتە ، ئۇلارنى ئۆچۈرەلمەيسىز ، LinRegPCR كېيىنكى باسقۇچلاردا بۇ نۇقتىلارغا سەل قارايدۇ)

رەسىم 5 qPCR سانلىق مەلۇمات ئېكسپورتى

كاندىدات ئەۋرىشكىسىنى تاللاش 6

سانلىق مەلۇمات كىرگۈزۈش:سالاھىيەت دەرىجىسىنى يۇقىرى كۆتۈرۈش نەتىجىسىنى ئېچىڭ.

LinRegPCR سانلىق مەلۇمات كىرگۈزۈشنىڭ 7-قەدەم باسقۇچلىرى

نەتىجىدە:ئەگەر تەكرارلاش بولمىسا ، گۇرۇپپىلاش تەلەپ قىلىنمايدۇ.ئەگەر تەكرارلاش بولسا ، گۇرۇپپىلاشنى ئەۋرىشكە گۇرۇپپىسىدا تەھرىرلىگىلى بولىدۇ ، پەرقلەندۈرگۈچكە گېننىڭ ئىسمى كىرگۈزۈلىدۇ ، ئاندىن ئوخشاش گېن ئاپتوماتىك گۇرۇپپىلىنىدۇ.ئاخىرىدا ، ھۆججەتنى چېكىپ ، ئېسىل ئېكسپورت قىلىڭ ۋە نەتىجىنى كۆرۈڭ.ھەر بىر قۇدۇقنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى ۋە R2 نەتىجىسى كۆرسىتىلىدۇ.ئىككىنچىدىن ، گۇرۇپپىلارغا بۆلسىڭىز ، تۈزىتىلگەن ئوتتۇرىچە كۈچەيتىش ئۈنۈمى كۆرۈلىدۇ.ھەر بىر قەغەزنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىنىڭ% 85 تىن% 115 كىچە بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.ئەگەر بەك چوڭ ياكى بەك كىچىك بولسا ، بۇ قەغەزنىڭ كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمىنىڭ ناچارلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ.

8-رەسىم نەتىجىسى ۋە سانلىق مەلۇمات چىقىرىش

تەجرىبە جەريانى:
RNA سۈپەت تەلىپى:
ساپلىقى:1.72.0 قالدۇق ئىزوتىئوكيانات بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىدۇ.پاكىز يادرو كىسلاتاسى A260 / A230 2 ئەتراپىدا بولۇشى كېرەك .ئەگەر 230 nm كۈچلۈك سۈمۈرۈلسە ، بۇ فېنات ئىئونى قاتارلىق ئورگانىك بىرىكمىلەرنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، ئۇنى% 1.5 ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى ئارقىلىق بايقىغىلى بولىدۇ.بەلگىنى كۆرسىتىڭ ، چۈنكى ssRNA نىڭ ئايرىشچانلىقى يوق ، مولېكۇلا ئېغىرلىقى لوگارىزىمنىڭ تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋىتى يوق ، مولېكۇلا ئېغىرلىقىنى توغرا ئىپادىلىگىلى بولمايدۇ.مەركەزلىشىش: نەزەرىيە جەھەتتىنئەمەس100ng / ul دىن تۆۋەن ، ئەگەر قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا ، ساپلىقى ئادەتتە ئېگىز بولمايدۇ

Fig9 RNA gel

بۇنىڭدىن باشقا ، ئەگەر ئەۋرىشكە قىممەتلىك بولۇپ ، RNA نىڭ قويۇقلۇقى يۇقىرى بولسا ، ئۇنى چىقىرىۋەتكەندىن كېيىن ئۇنى ئېلىۋېتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ ، ھەمدە RNA نى سۇيۇقلاندۇرۇپ ، ئەڭ ئاخىرقى قويۇقلۇقى 100-300ng / ul غا تەتۈر كۆچۈرۈلىدۇ.Inتەتۈر كۆچۈرۈش جەريانىmRNA كۆچۈرۈلگەندە ، polyA قۇيرۇقىغا ئالاھىدە باغلىنالايدىغان oligo (dt) پىرىسلاش ماشىنىسى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشكە ئىشلىتىلىدۇ ، lncRNA ۋە circRNA بولسا RNA نىڭ ئومۇمىي تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ئۈچۈن ئىختىيارى ئالتە تەرەپلىك (ئىختىيارى 6 mer) پىرىسلىغۇچ ئىشلىتىلىدۇ.ھازىر نۇرغۇن شىركەتلەر مەخسۇس قۇيرۇق زاپچاسلىرىنى چىقاردى.غول ئايلاندۇرۇش ئۇسۇلىغا نىسبەتەن ، قۇيرۇق قۇيۇش ئۇسۇلى تېخىمۇ قۇلايلىق ، يۇقىرى ئۈنۈملۈك ۋە رېئاكتىپ تېجەشچان بولىدۇ ، ئەمما ئوخشاش بىر ئائىلىدىكى miRNA نى پەرقلەندۈرۈشنىڭ ئۈنۈمى غول ئايلانما ئۇسۇلدەك ياخشى بولماسلىقى كېرەك.ھەر بىر تەتۈر ترانسكرىپسىيە زاپچاسلىرىنىڭ گېنغا خاس پىرىمېرلارنىڭ (غول ھالقىسى) قويۇقلۇقىغا بولغان تەلىپى بار.MiRNA ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن ئىچكى پايدىلىنىش U6.غول ئايلانما ئايلىنىش جەريانىدا ، U6 تۇرۇبىسىنى ئايرىم-ئايرىم كەينىگە قايتۇرۇش ، U6 نىڭ ئالدى-كەينى پىرىسلىرىنى بىۋاسىتە قوشۇش كېرەك.CircRNA ۋە lncRNA ھەر ئىككىسى HKG نى ئىچكى پايدىلىنىش ئورنىدا ئىشلىتەلەيدۇ.IncDNA بايقاش ،
ئەگەر RNA دا مەسىلە بولمىسا ، cDNA مۇ ياخشى بولۇشى كېرەك.قانداقلا بولمىسۇن ، تەجرىبىنىڭ مۇكەممەللىكى ئەمەلگە ئاشۇرۇلسا ، ئەڭ ياخشىسى gDNA نى cd بىلەن پەرقلەندۈرەلەيدىغان ئىچكى پايدىلىنىش گېنى (پايدىلىنىش گېنى ، RG) ئىشلىتىش كېرەك.ئادەتتە ، RG ئۆي ئاسراش گېنى.، HKG) 10-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك.ئۇ ۋاقىتتا مەن سېرىق پۇرچاق ساقلاش ئاقسىلى ياساۋاتاتتىم ، ھەمدە ئىچكى ئاجراتما سۈپىتىدە ئاكتىن 7 نى ئىشلەتتىم.GDNA دىكى بۇ پىرىزمنىڭ كۈچەيتىلگەن پارچىسىنىڭ چوڭلۇقى 452bp ، ئەگەر cDNA قېلىپ قىلىپ ئىشلىتىلگەن بولسا ، 142bp ئىدى.ئاندىن سىناق نەتىجىسى CDNA نىڭ بىر قىسمىنىڭ ئەمەلىيەتتە gDNA تەرىپىدىن بۇلغانغانلىقىنى بايقىدى ، شۇنداقلا ئۇ تەتۈر كۆچۈرۈش نەتىجىسىدە مەسىلە يوقلىقىنى ، ئۇنى PCR ئۈچۈن قېلىپ قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدىغانلىقىنى ئىسپاتلىدى.CDNA بىلەن بىۋاسىتە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېزنى ئىشلىتىشنىڭ پايدىسى يوق ، ئۇ تارقاق بەلۋاغ بولۇپ ، قايىل قىلارلىق ئەمەس.

10-رەسىم cDNA بايقاش

QPCR شەرتلىرىنى بەلگىلەشئادەتتە يۈرۈشلۈك كېلىشىمگە ئاساسەن مەسىلە يوق ، ئاساسلىقى tm قىممىتى باسقۇچىدا.ئەگەر دەسلەپكى پىرىسلاش جەريانىدا بەزى پىرىمچىكلار ياخشى لايىھەلەنمىسە ، tm قىممىتى بىلەن نەزەرىيە 60 ° C ئارىسىدا زور پەرق پەيدا قىلسا ، cDNA ئەۋرىشكىلەر ئارىلاشتۇرۇلغاندىن كېيىن ، گىرىم بۇيۇملىرى بىلەن PCR نى ئىجرا قىلىپ ، تېمپېراتۇرىنى TM قىممىتى قىلىپ بەلگىلەشتىن ساقلىنىڭ.

سانلىق مەلۇمات ئانالىزى

ئادەتتىكى نىسپىي فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇلى ئاساسەن 2 گە ئاساسەن-ΔΔCT.سانلىق مەلۇمات بىر تەرەپ قىلىش ئەندىزىسى.

مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:

ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئاسان^TM –قاقمان

ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئاسان^TM –SYBR GREEN I.

RT Easy I (Master stramix for first strand cDNA synthesis)

RT Easy II (qPCR ئۈچۈن بىرىنچى قاتاردىكى cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ Master Premix)