• facebook
  • linkedin
  • youtube

new1

. ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ سەزگۈرلۈكىنى ئاشۇرۇش:

1. يۇقىرى سۈپەتلىك RNA نى ئايرىڭ:

مۇۋەپپەقىيەتلىك cDNA بىرىكتۈرۈش يۇقىرى سۈپەتلىك RNA دىن كېلىدۇ.يۇقىرى سۈپەتلىك RNA كەم دېگەندە ئومۇمىي ئۇزۇنغا كاپالەتلىك قىلىشى ھەمدە EDTA ياكى SDS قاتارلىق خاتىرىلەش فېرمېنتى بولمىغان چەكلىگۈچنى ئۆز ئىچىگە ئالماسلىقى كېرەك.RNA نىڭ سۈپىتى سىز cDNA غا كۆچۈرەلەيدىغان تەرتىپ ئۇچۇرلىرىنىڭ ئەڭ چوڭ قىممىتىنى بەلگىلەيدۇ.ئادەتتىكى RNA نى تازىلاش ئۇسۇلى ئىزوكيانات / كىسلاتالىق فېنولنى ئىشلىتىشنىڭ باسقۇچلۇق ئۇسۇلى.RNase نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ، RNase مول بولغان ئەۋرىشكە (ئاشقازان ئاستى بېزىگە ئوخشاش) دىن ئايرىلغان RNA يۇقىرى سۈپەتلىك RNA نى تېجەش ئۈچۈن فورمالدېگىد ساقلاشنى تەلەپ قىلىدۇ ، بۇ ئۇزۇن مۇددەت ساقلاشقا تېخىمۇ ماس كېلىدۇ.چاشقان جىگىرىدىن ئېلىنغان RNA بىر ھەپتە سۇدا ساقلانغاندىن كېيىن ئاساسىي جەھەتتىن ناچارلاشقان ، چاشقان تېرىسىدىن ئېلىنغان RNA ئۈچ يىل سۇدا ساقلانغاندىن كېيىن مۇقىم بولغان.بۇنىڭدىن باشقا ، 4kb دىن چوڭ بولغان خاتىرىلەر كىچىك خاتىرىلەرگە قارىغاندا RNase نىڭ تۆۋەنلىشىنى ئىز قوغلاشقا تېخىمۇ سەزگۈر.ساقلاش RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ مۇقىملىقىنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، RNA ئىئوننىڭ مېتامىنمىندا ئېرىپ ، ° C70- قا ساقلىنىدۇ.RNA نى تېجەشتە ئىشلىتىلىدىغان تىلىد تەركىبىدە RNA نى تۆۋەنلىتىدىغان ھەرخىل جىسىملار بولماسلىقى كېرەك.ئاشقازان ئاستى بېزىدىن ھاسىل بولغان RNA مېتامىنمىندا كەم دېگەندە بىر يىل ساقلىغىلى بولىدۇ.RNA نى ئىشلىتىشكە تەييارلانغاندا ، تۆۋەندىكى ئۇسۇللارنى ئىشلىتىپ RNA نى چۆكتۈرەلەيسىز: NaCl نى 0.2m ۋە ئېتانولنىڭ 4 ھەسسىسىگە قوشۇڭ ، ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىنى 3-5 مىنۇت ، 10،000 × گرام مەركەزدىن 5 مىنۇتقىچە قوشۇڭ.

2. RNaseH پائالىيىتى (RNaseH-) بولماي تۇرۇپ تەتۈر كۆچۈرۈلمە ئىشلىتىڭ :

RNase چەكلىگۈچ كۆپىنچە تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىغا قوشۇلۇپ ، cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئۇزۇنلۇقى ۋە ھوسۇلىنى ئاشۇرىدۇ.RNase ئىنگىبىتور بىرىنچى زەنجىرسىمان بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىدە بۇففېر ۋە DTT قاتارلىق ۋاكالەتچىلەرنى ئازايتىدۇ ، چۈنكى cDNA دىن بۇرۇنقى بىرىكتۈرۈش جەريانى چەكلىگۈچنى رەت قىلىدۇ ، بۇ ئارقىلىق RNA نى تۆۋەنلىتىدىغان باغلانغان RNases قويۇپ بېرىدۇ.ئاقسىل RNase چەكلىگۈچ پەقەت RNase A, B, C نىڭ RNA نىڭ بۇزۇلۇشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ، ھەمدە تېرىدىكى RNases نىڭ ئالدىنى ئالمايدۇ ، شۇڭا بۇ چەكلەش دورىلىرىنى ئىشلەتكەن بولۇشىغا قارىماي ، بارماقتىن RNases نى كىرگۈزمەسلىككە دىققەت قىلىش كېرەك.

تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNA نىڭ cDNA غا ئايلىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ.M-MLV ۋە AMV ھەر ئىككىلىسىنىڭ ئۆزلۈكىدىن كۆپ قۇتۇپلىشىش پائالىيىتىدىن باشقا ، ئۆزلۈكىدىن RNaseH پائالىيىتى بار.RNaseH پائالىيىتى RNA قېلىپى بىلەن DNA ئەۋرىشكىسى ياكى cDNA كېڭەيتىش بەلبېغى ئارىسىدا شەكىللەنگەن گېروزوگېنلىق بەلۋاغنىڭ پولىمېرازا پائالىيىتى بىلەن رىقابەتلىشىدۇ ۋە RNA: DNA گۇرۇپپىسىدىكى RNA تاللىرىنى تۆۋەنلىتىدۇ.RNaseH پائالىيىتى تەرىپىدىن بۇزۇلغان RNA قېلىپىنى ئەمدى cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئۈنۈملۈك تارماق ئورنى قىلىپ ئىشلىتىشكە بولمايدۇ ، cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ مەھسۇلات مىقدارى ۋە ئۇزۇنلۇقى تۆۋەنلەيدۇ.شۇڭا تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNaseH پائالىيىتىنى يوقىتىش ياكى زور دەرىجىدە ئازايتىش زور پايدىسى بار.

SuperScriptⅡ تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ، RNaseH نىڭ MMLV تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىسى ۋە thermoScript تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىسى ، RNaseH نىڭ AMV- MMLV ۋە AMV غا قارىغاندا تېخىمۇ ئۇزۇن ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA ھاسىل قىلدى.RT-PCR سەزگۈرلۈكى cDNA بىرىكتۈرۈلگەن مىقدارنىڭ تەسىرىگە ئۇچرايدۇ.ThermoScript AMV غا قارىغاندا تېخىمۇ سەزگۈر.RT-PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ چوڭلۇقى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ cDNA نى بىرىكتۈرۈش ئىقتىدارى بىلەن چەكلىنىدۇ ، بولۇپمۇ چوڭراق Cdnas نى كلونلىغاندا.MMLV غا سېلىشتۇرغاندا ، SuperScripⅡ ئۇزۇن RT-PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى كۆرۈنەرلىك ئاشۇردى.RNaseH-'s نىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈشىمۇ ئىسسىقلىق مۇقىملىقىنى ئاشۇرىدۇ ، شۇڭا ئىنكاس 37-42 normal دىن يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ئېلىپ بېرىلسا بولىدۇ.تەۋسىيە قىلىنغان سىنتېزلاش شارائىتىدا ، oligo (dT) پىرىمېر ۋە 10μCi [alpha-p] dCTP ئىشلىتىلگەن.بىرىنچى زەنجىرنىڭ ئومۇمىي ئىشلەپچىقىرىش مىقدارى TCA يامغۇر يېغىش ئۇسۇلى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA چوڭ-كىچىكلىكى تەرتىپلىك بەلۋاغنى ئېلىۋېتىش ۋە ئىشقارلىق ئاگاروزا گېلىدا ساناش ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.

3. تەتۈر ترانسكرىپسىيەنىڭ ئىسسىقلىقنى ساقلاش تېمپېراتۇرىسىنى ئاشۇرۇش :

يۇقىرى تېمپېراتۇرا RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى ئېچىشقا ۋە ئىنكاسنىڭ ھوسۇلىنى ئاشۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ.كۆپىنچە RNA قېلىپىغا نىسبەتەن ، RNA ۋە پىرىسنى 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق بۇففېر ياكى تۇزسىز تۇتۇپ ئاندىن مۇزدا تېز سوۋۇتۇش كۆپىنچە ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلارنى يوقىتىدۇ ۋە پىرىمېرلارنىڭ باغلىنىشىغا يول قويىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، بەزى قېلىپلار ئىسسىقلىق ئايرىشتىن كېيىنمۇ ئىككىنچى دەرىجىلىك قۇرۇلمىغا ئىگە.بۇ قىيىن قېلىپلارنى كۈچەيتىش ThermoScript تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن ۋە تەتۈر كۆچۈرۈلگەن رېئاكسىيەنى تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىغا قويۇپ ، كۈچەيتكىلى بولىدۇ.يۇقىرى تېمپېراتۇرىلىق تېمپېراتۇرامۇ خاسلىقنى ئاشۇرالايدۇ ، بولۇپمۇ cDNA بىرىكتۈرۈش گېنغا خاس پىرىس (GSPS) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلغاندا (3-بابقا قاراڭ).ئەگەر GSP ئىشلىتىۋاتقان بولسىڭىز ، دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ Tm قىممىتى مۆلچەردىكى ساقلاش تېمپېراتۇرىسى بىلەن ئوخشاش بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.60 above دىن يۇقىرى oligo (dT) ۋە تاسادىپىي پىرىسلارنى ئىشلەتمەڭ.ئىختىيارى پىرىمېرلار 60 at گە ئۆرلەشتىن بۇرۇن 25 at 10 مىنۇتتا 10 مىنۇت ساقلىنىشى كېرەك.تېخىمۇ يۇقىرى تەتۈر ترانسكرىپسىيە تېمپېراتۇرىسىنى ئىشلەتكەندىن باشقا ، RNA / پىرىمات ئارىلاشمىسىنى 65 ℃ ئايرىش تېمپېراتۇرىسىدىن بىۋاسىتە تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى ساقلاش تېمپېراتۇرىسىغا يۆتكەش ۋە قىزىغان 2 × رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى (cDNA ئىسسىقلىق قوزغىتىش بىرىكمىسى) نى قوشۇش ئارقىلىق كونكرېتلىقنى ياخشىلىغىلى بولىدۇ.بۇ خىل ئۇسۇل تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا يۈز بېرىدىغان ئارىلىق ئارىلىقىدىكى ئاساسى جۈپلىشىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.PCR ئەسۋابىنى ئىشلىتىش RT-PCR ئۈچۈن كېرەكلىك نۇرغۇن تېمپېراتۇرا ئالماشتۇرۇشنى ئاددىيلاشتۇرىدۇ.

Tth ئىسسىقلىق مۇقىملاشتۇرۇلغان پولىمېرازا Mg2 + ۋە RNA پولىمېراسى Mn2 + نىڭ ئالدىدا DNA پولىمېراسى رولىنى ئوينايدۇ.ئۇ 65 heat غىچە ئىسسىقلىق ساقلىيالايدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، PCR دەۋرىدە Mn2 + نىڭ بولۇشى ساداقەتمەنلىكنى تۆۋەنلىتىدۇ ، بۇ Tth پولىمېرازانىڭ cDNA كلونلاش قاتارلىق يۇقىرى ئېنىقلىق دەرىجىسىنى ئاشۇرۇشقا ماس كەلمەيدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، Tth تەتۈر كۆچۈرۈلۈشتە ئۈنۈمى تۆۋەن بولىدۇ ، بۇ سەزگۈرلۈكنى تۆۋەنلىتىدۇ ، يەككە فېرمېنت تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە PCR ئىشلىتەلەيدىغان بولغاچقا ، تەتۈر كۆچۈرۈلمىگەن كونترول رېئاكسىيەسىنى cDNA نىڭ كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتلىرىنى بۇلغانغان گېن DNA بىلەن پەرقلەندۈرۈشكە ئىشلىتىشكە بولمايدۇ.

4. تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنى ئىلگىرى سۈرىدىغان خۇرۇچ :

تۇنجى زەنجىرسىمان بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىگە گلىتسېرىن ۋە DMSO قاتارلىق خۇرۇچلارنىڭ قوشۇلۇشى يادرو كىسلاتاسىنىڭ قوش تاسمىسىنىڭ مۇقىملىقىنى تۆۋەنلىتىدۇ ۋە RNA ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى بىكار قىلالايدۇ.SuperScriptⅡ ياكى MMLV نىڭ پائالىيىتىگە تەسىر كۆرسەتمەيلا% 20 لىك گلىتسېرىن ياكى% 10 DMSO نى قوشقىلى بولىدۇ.AMV يەنە پائالىيەتنى ئازايتماي% 20 لىك گلىتسېرىنغا بەرداشلىق بېرەلەيدۇ.SuperScriptⅡ تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكسىيەسىدىكى RT-PCR نىڭ سەزگۈرلۈكىنى ئەڭ يۇقىرى چەكتە ئاشۇرۇش ئۈچۈن ،% 10 لىك گلىتسېرىننى قوشقىلى ۋە 45 at قويغىلى بولىدۇ.ئەگەر PCR غا retrotranscription-reaction مەھسۇلاتنىڭ 1/10 ى قوشۇلسا ، كۈچەيتكۈچ رېئاكسىيەسىدىكى گلىتسېرىننىڭ قويۇقلۇقى% 0.4 بولىدۇ ، بۇ PCR نى چەكلەشكە يەتمەيدۇ.

5. RNaseH بىر تەرەپ قىلىش :

PCR دىن بۇرۇن RNaseH بىلەن cDNA بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىنى داۋالاش ئارقىلىق سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ.بەزى قېلىپلارغا نىسبەتەن ، cDNA بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىدىكى RNA كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتلارنىڭ باغلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ دەپ قارىلىدۇ ، بۇنداق بولغاندا RNaseH داۋالاش سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرالايدۇ.ئادەتتە ، RNaseH داۋالاش بىر قەدەر ئۇزۇن بولغان cDNA نىشان قېلىپىنى كېڭەيتىش ئۈچۈن تەلەپ قىلىنىدۇ ، مەسىلەن تۆۋەن كۆچۈرۈلگەن تۇبېركۇليوز قېتىشىش قاتارلىقلار.بۇ قىيىن قېلىپ ئۈچۈن ، RNaseH SuperScriptⅡ ياكى AMV بىرىكتۈرگەن cDNA ھاسىل قىلغان سىگنالنى كۈچەيتتى.كۆپىنچە RT-PCR ئىنكاسىغا نىسبەتەن ، RNaseH نى داۋالاش ئىختىيارىي بولىدۇ ، چۈنكى 95 ℃ ئىزولياتورلۇق PCR ئايرىش باسقۇچى ئادەتتە RNA: DNA دىن RNA نى ھىدرولىزلايدۇ.

6. ئاز مىقداردىكى RNA نى بايقاش ئۇسۇللىرى ياخشىلاندى

پەقەت ئاز مىقداردىكى RNA ئىشلەتكەندە RT-PCR ئالاھىدە قىيىن.RNA ئايرىش جەريانىدا گلىكوگېننىڭ توشۇغۇچى سۈپىتىدە قوشۇلۇشى كىچىك ئەۋرىشكىلەرنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ.Trizol بىلەن بىر ۋاقىتتا RNase بولمىغان گلىكوگېننى قوشقىلى بولىدۇ.گلىكوگېن سۇدا ئېرىيدىغان بولۇپ ، RNA بىلەن سۇ باسقۇچىدا قېلىپ ، كېيىنكى ھۆل-يېغىنغا ياردەم بېرەلەيدۇ.تەۋسىيە قىلىنغان قويۇقلۇقى RNase بولمىغان گلىكوگېننىڭ مىقدارى 50mg دىن تۆۋەن ئەۋرىشكە ياكى 106 مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرە ئۈچۈن 250μg / ml.

SuperScriptⅡ ئارقىلىق ترانسكرىپسىيە رېئاكسىيەسىگە تەتۈر كۆچۈرۈلگەن BSA قوشۇلسا ، سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ ، ئاز مىقداردىكى RNA غا نىسبەتەن ، SuperScriptⅡ نىڭ مىقدارىنى ئازايتىپ ، 40 بىرلىك RnaseOut يادرو چەكلىگۈچنى قوشقاندا بايقاش دەرىجىسىنى ئۆستۈرگىلى بولىدۇ.ئەگەر گلىكوگېن RNA ئايرىشتا ئىشلىتىلسە ، BSA ياكى RNase چەكلىگۈچنى SuperScriptⅡ ئارقىلىق تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىغا قوشۇش يەنىلا تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

. RT-PCR نىڭ خاسلىقىنى ئاشۇرۇش

1. cNDA بىرىكمىسى :

ئۈچ خىل ئوخشىمىغان ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ ، بىرىنچى قاتاردىكى cDNA بىرىكتۈرۈشنى قوزغىتىشقا بولىدۇ ، ھەر بىر ئۇسۇلنىڭ نىسپىي ئالاھىدىلىكى بىرىكتۈرۈلگەن cDNA نىڭ مىقدارى ۋە تۈرىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.

ئىختىيارىي دەسلەپكى ئۇسۇل ئۈچ خىل ئۇسۇلنىڭ ئىچىدە ئەڭ ئاز كونكرېت.پىرىمېرلار قىسقا ، قىسمەن ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ، پۈتۈن خاتىرىدىكى بىر نەچچە بېكەتكە چاپلىنىدۇ.بۇ ئۇسۇل ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونلىرى بولغان RNA قېلىپىدىن 5 ′ تېرمىنال تەرتىپى ۋە cDNA غا ئېرىشىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.ئەڭ ئۇزۇن cDNA غا ئېرىشىش ئۈچۈن ، ھەر بىر RNA ئەۋرىشكىسىدىكى پىرىمېرلارنىڭ RNA بىلەن بولغان نىسبىتىنى تەجرىبە جەھەتتىن ئېنىقلاش كېرەك.ئىختىيارى پىرىمېرلارنىڭ دەسلەپكى قويۇقلۇقى 20 مىللىمېتىر رېئاكسىيە سىستېمىسىدا 50 دىن 250ng غىچە.تاسادىپىي پىرىسلاش ئارقىلىق ئومۇمىي RNA دىن بىرىكتۈرۈلگەن cDNA ئاساسلىقى رىبوسومال RNA بولغاچقا ، پولى (A) + RNA ئادەتتە قېلىپ قىلىپ تاللىنىدۇ.

Oligo (dT) قوزغىتىش تاسادىپىي پىرىمېرلارغا قارىغاندا تېخىمۇ كونكرېت.ئۇ كۆپىنچە ئېۋكارىئوتىك ھۈجەيرىلەردە mRNA نىڭ 3 ′ ئۇچىدا بايقالغان پولى (A) قۇيرۇقى بىلەن بىرىكىدۇ.كۆپ قۇتۇپلۇق (A) + RNA ئومۇمىي RNA نىڭ تەخمىنەن% 1 تىن% 2 كىچە بولغانلىقى ئۈچۈن ، cDNA نىڭ مىقدارى ۋە مۇرەككەپلىكى تاسادىپىي پىرىسلانغانلارغا قارىغاندا كۆپ تۆۋەن.يۇقىرى ئېنىقلىق دەرىجىسى بولغاچقا ، oligo (dT) ئادەتتە RNA نىڭ دەسلەپكى نىسبىتى ۋە پولى (A) + تاللىشىنى ئەلالاشتۇرۇشنى تەلەپ قىلمايدۇ.ھەر 20μl رېئاكسىيە سىستېمىسىغا 0.5μg oligo (dT) ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.oligo (dT) 12-18 كۆپىنچە RT-PCR غا ماس كېلىدۇ.ThermoScript RT-PCR سىستېمىسى ئىسسىقلىق مۇقىملىقى ياخشى بولغاچقا ، oligo (dT) 20 بىلەن تەمىنلەيدۇ ھەمدە يۇقىرى تېمپېراتۇرىنى ساقلاشقا ماس كېلىدۇ.

گېنغا خاس پىرىسلاش (GSP) تەتۈر كۆچۈرۈش باسقۇچىدىكى ئەڭ ياخشى ئالاھىدە پىرىس.GSP ئانتىتېلاغا قارشى ئولېگونۇكلېئوسىد بولۇپ ، ئۇ RNA مەنزىل تەرتىپى بىلەن ئالاھىدە بىرىكىدۇ ، بارلىق Rnas نى تاسادىپىي پىرىمېر ياكى ئولىگو (dT) غا باغلىمايدۇ.PCR پىرىمېرلىرىنى لايىھىلەشتە قوللىنىلغان قائىدىلەر تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكسىيەسى GSP لايىھىلىنىشىگىمۇ ماس كېلىدۇ.GSP mRNA3 of نىڭ ئاخىرىغا ئۇلانغان كۈچەيتكۈچ پرىنتېر بىلەن ئوخشاش تەرتىپ بولالايدۇ ، ياكى GSP نى تەتۈر كۈچەيتكۈچ بىلەن تۆۋەن ئېقىنغا تۇتاشتۇرغىلى بولىدۇ.بەزى كۈچەيتىلگەن ئوبيېكتلارغا نىسبەتەن ، RT-PCR نىڭ مۇۋەپپەقىيەتلىك بولۇشى ئۈچۈن بىردىن كۆپ ۋىرۇسقا قارشى تۇرۇش لايىھىسىنى لايىھىلەش كېرەك ، چۈنكى نىشان RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسى قەغەزنىڭ باغلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.20 مىللىمېتىرلىق تۇنجى زەنجىرسىمان بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيە سىستېمىسىدا 1pmol ۋىرۇسقا قارشى GSP ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

2. تەتۈر ترانسكرىپسىيەنىڭ ئىسسىقلىقنى ساقلاش تېمپېراتۇرىسىنى ئاشۇرۇش :

GSP ئالاھىدىلىكىدىن تولۇق پايدىلىنىش ئۈچۈن ، يۇقىرى ئىسسىقلىق مۇقىملىقى بىلەن تەتۈر كۆچۈرۈلمە ئىشلىتىش كېرەك.ئىسسىقلىق تۇراقلىق تەتۈر كۆچۈرۈلۈش تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ئىزولياتورلۇق قىلىپ ، ئىنكاسنىڭ قاتتىقلىقىنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ.مەسىلەن ، ئەگەر GSP 55 سېلسىيە گرادۇستا تۇتاشتۇرۇلسا ، ئۇنداقتا AMV ياكى M-MLV ئارقىلىق تۆۋەن قاتتىقلىق بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇستا تەتۈر كۆچۈرۈلسە GSP نىڭ ئالاھىدىلىكى تولۇق ئىشلىتىلمەيدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، SuperScripⅡ ۋە ThermoScript 50 ℃ ياكى ئۇنىڭدىن يۇقىرى بولغاندا ئىنكاس قايتۇرالايدۇ ، بۇ تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ئىشلەپچىقىرىلغان ئەھمىيەتسىز مەھسۇلاتلارنى يوقىتىدۇ.ئەڭ چوڭ ئېنىقلىق ئۈچۈن ، RNA / primer ئارىلاشمىسىنى 65 ℃ ئايرىش تېمپېراتۇرىسىدىن بىۋاسىتە قىزىتىلغان 2 x رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى (cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئىسسىقلىق قوزغىتىشى) قوشقاندا تەتۈر ترانسكرىپسىيە ساقلاش تېمپېراتۇرىسىغا بىۋاسىتە يۆتكىگىلى بولىدۇ.بۇ تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا مولېكۇلا ئارىسىدىكى ئاساسى جۈپلىشىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.PCR ئەسۋابىنى ئىشلىتىش RT-PCR ئۈچۈن تەلەپ قىلىنغان نۇرغۇن تېمپېراتۇرا ئۆتكۈنچىسىنى ئاددىيلاشتۇرىدۇ.

3. گېن گۇرۇپپىسىنىڭ بۇلغىنىشىنى ئازايتىش :

RT-PCR دىكى بىر يوشۇرۇن قىيىنچىلىق شۇكى ، RNA گېن گۇرۇپپىسىنى بۇلغايدۇ.Trizol Reagent غا ئوخشاش تېخىمۇ ياخشى RNA ئايرىش ئۇسۇلىنى قوللىنىش RNA تەييارلىقىدىكى گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA بۇلغىنىشىنى ئازايتىدۇ.گېن DNA دىن ئىشلەپچىقىرىلغان مەھسۇلاتلاردىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، RNA نى كۈچەيتىش دەرىجىسى DnasⅠ ئارقىلىق داۋالىغىلى بولىدۇ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈشتىن ئىلگىرى بۇلغانغان DNA نى ئېلىۋەتكىلى بولىدۇ.ئەۋرىشكەلەر DNaseⅠ ھەزىم قىلىشنى ئاخىرلاشتۇرۇش ئۈچۈن 2.0mM EDTA دا 65 at 10 مىنۇت ساقلانغان.EDTA ماگنىي ئىئونىنى خىلىتلاپ ، يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا يۈز بېرىدىغان ماگنىي ئىئونىغا تايىنىدىغان RNA گىدرولىزنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.

كۈچەيتىلگەن cDNA نى گېننىڭ DNA كۈچەيتكۈچ مەھسۇلاتىدىن ئايرىش ئۈچۈن ، ئايرىلغان exon بىلەن ئايرىم-ئايرىم تۇتاشتۇرۇلغان پىرىمېرلارنى لايىھىلەپ چىقالايدۇ.CDNA دىن ھاسىل قىلىنغان PCR مەھسۇلاتلىرى بۇلغانغان گېن گۇرۇپپىسىدىن قىسقا بولىدۇ.ھەر بىر RNA قېلىپىدا تەتۈر كۆچۈرۈلمەي كونترول قىلىنىدىغان تەجرىبە ئېلىپ بېرىلىپ ، بېرىلگەن بۆلەكنىڭ گېن DNA ياكى CDNA دىن ئىكەنلىكى ئېنىقلىنىدۇ.تەتۈر كۆچۈرۈلمىگەن ئەھۋال ئاستىدا ئېرىشكەن PCR مەھسۇلاتلىرى گېندىن كەلگەن.

مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلات

new2

 

RT-PCR ئاسانᵀᴹمەن (بىر قەدەم)

-بىر باسقۇچلۇق يۈرۈشلۈك زاپچاس تەتۈر ترانسكرىپسىيە ۋە PCR نىڭ ئوخشاش تۇرۇبىدا ئېلىپ بېرىلىشىنى تەمىنلەيدۇ.ئۇ پەقەت قېلىپ RNA ، كونكرېت PCR پىرىسلىغۇچ ۋە RNase-Free ddH نى قوشۇشى كېرەك2O.

-RNA نىڭ ھەقىقىي ۋاقىتتىكى مىقدار ئانالىزىنى تېز ۋە توغرا ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.

-بۇ زاپچاستا ئۆزگىچە Foregene تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكتورى ۋە Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئۆزگىچە ئىنكاس سىستېمىسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئىنكاسنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى ۋە خاسلىقى ئۈنۈملۈك يۇقىرى كۆتۈرۈلگەن.

- ئەلالاشتۇرۇلغان ئىنكاس سىستېمىسى ئىنكاسنىڭ بايقاش سەزگۈرلۈكىنى تېخىمۇ يۇقىرى قىلىدۇ ، ئىسسىقلىقنىڭ مۇقىملىقى ۋە بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارىنى تېخىمۇ ياخشى قىلىدۇ.

new3

 

RT Easy II (GDNase بىلەن) GDNase بىلەن ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR ئۈچۈن بىرىنچى قاتاردىكى CDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئاساسلىق مۇقەددىمىسى

-GDNA نى چىقىرىۋېتىشنىڭ ئۈنۈملۈك ئىقتىدارى ، ئۇ 2 مىنۇت ئىچىدە قېلىپتىكى gDNA نى ئۆچۈرەلەيدۇ.

-ئۈچۈن تەتۈر كۆچۈرۈش سىستېمىسى ، بىرىنچى تال CDNA نىڭ بىرىكىشىنى تاماملاشقا پەقەت 15 مىنۇت ۋاقىت كېتىدۇ.

- مۇرەككەپ قېلىپلار: يۇقىرى GC مەزمۇنى ۋە مۇرەككەپ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسى بار قېلىپلارنىمۇ يۇقىرى ئۈنۈم بىلەن قايتۇرغىلى بولىدۇ.

-ئۆز سەزگۈرلۈك تەتۈر ترانسكرىپسىيە سىستېمىسى ، pg دەرىجىلىك قېلىپلارمۇ يۇقىرى سۈپەتلىك cDNA غا ئېرىشەلەيدۇ.

- تەتۈر كۆچۈرۈلۈش سىستېمىسىنىڭ ئىسسىقلىق مۇقىملىقى يۇقىرى ، ئەڭ ياخشى ئىنكاس تېمپېراتۇرىسى 42 and ، ئۇ يەنىلا 50 at لىك تەتۈر كۆچۈرۈش ئىقتىدارىغا ئىگە.


يوللانغان ۋاقتى: 07-مارتتىن 20-مارتقىچە