دەسلەپكى لايىھىلەش ئاساسى (99% مەسىلىنى ھەل قىلغىلى بولىدۇ)
1. دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى: دەرسلىك 15-30bp غا ئېھتىياجلىق ، ئادەتتە 20bp ئەتراپىدا.كونكرېت ئەھۋالغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ئەمەلىي شارائىت 18-24bp بولغان ياخشى ، ئەمما قانچە ئۇزۇن بولسا شۇنچە ياخشى ، بەك ئۇزۇن بولغان پىرىمچىكمۇ كونكرېتلىقنى تۆۋەنلىتىدۇ ھەمدە مەھسۇلاتنى ئازايتىدۇ.
2. دەسلەپكى كېڭەيتىش دائىرىسى: 200-500bp ماس كېلىدۇ ، ئالاھىدە شارائىتتا پارچىسىنى 10kb غا كېڭەيتكىلى بولىدۇ.
3. دەسلەپكى ئاساسى: G + C نىڭ مەزمۇنى% 40-60 بولۇشى كېرەك ، بەك ئاز G + C كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمى ياخشى ئەمەس ، بەك كۆپ G + C ئالاھىدە بەلۋاغنى كۆرسىتىش ئاسان.ATGC ئەڭ ياخشىسى ئىختىيارى تارقىتىلغان بولۇپ ، 5 دىن ئارتۇق پۇرىن ياكى پىرامىدېن يادروسى توپىدىن ساقلىنىدۇ.مۇقىملىقنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن 5 ′ ئاخىرى ۋە ئارىلىق تەرتىپى ئۈچۈن Multi-gc ، 3 ′ ئۇچىدىكى مول GC دىن ساقلىنىڭ ، ئاخىرقى 3 بازىدا GC يوق ، ياكى يېقىنقى 5 بازىنىڭ ئۈچىدە GC يوق.
4. پىرىمېرلاردا ئىككىلەمچى قۇرۇلمىدىن ساقلىنىڭ ، ھەمدە ئىككى پىرىمېرنىڭ تولۇقلىنىشىدىن ساقلىنىڭ ، بولۇپمۇ 3 'ئاخىرىدىكى تولۇقلاشتىن ساقلىنىڭ ، بولمىسا دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقى شەكىللىنىپ ، ئالاھىدە كۈچەيتىلگەن بەلۋاغ ھاسىل بولىدۇ.
5. پىرىمېرلارنىڭ 3 'ئۇچىدىكى بازىلار ، بولۇپمۇ ئاخىرقى ۋە ئاخىرقى بازىلارنى قاتتىق جۈپلەشتۈرۈپ ، تېرمىنال ئاساسى بولمىغاچقا PCR مەغلۇبىيىتىدىن ساقلىنىش كېرەك.
6. پىرىمېرلار مۇۋاپىق تازىلاش تور بېكىتى بار ياكى قوشقىلى بولىدۇ ، كۈچەيتىلگەن نىشان تەرتىپى ئەڭ ياخشىسى مۇۋاپىق تازىلاش تور بېكىتى بولۇشى كېرەك ، بۇ تازىلاش ئانالىزى ياكى مولېكۇلا كلونلاشقا ئىنتايىن پايدىلىق.
7. پىرىمېرلارنىڭ ئالاھىدىلىكى: پىرىمېرلارنىڭ يادرو كىسلاتاسى رەت تەرتىپى سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىكى باشقا تەرتىپلەر بىلەن روشەن گومولوگىيە بولماسلىقى كېرەك.
8. يۇمشاق دېتال ئىشلىتىشنى ئۆگىنىۋېلىڭ: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (بۇ تور لايىھىسى ئەڭ ياخشى ئىشلەيدۇ).
يۇقارقى مەزمۇنلار كەم دېگەندە 99% دەسلەپكى لايىھىلەش مەسىلىسىنى ھەل قىلالايدۇ.
دەسلەپكى لايىھىلەشنىڭ تەپسىلاتلىرىنى كونترول قىلىڭ
1. دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى
ئادەتتىكى دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى 18 ~ 30 ئاساسى.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، پىرىماتنىڭ يېپىشقاق تېمپېراتۇرىسىنى بەلگىلەيدىغان ئەڭ مۇھىم ئامىل پىرىمنىڭ ئۇزۇنلۇقى.پىرىمېرنىڭ ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئادەتتە تاللىنىدۇ (Tm قىممىتى -5 ℃) ، بەزىلىرى بىۋاسىتە Tm قىممىتىنى ئىشلىتىدۇ.تۆۋەندىكى فورمۇلانى پىرىمېرلارنىڭ ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى تەخمىنەن ھېسابلاشقا بولىدۇ.
قەغەزنىڭ ئۇزۇنلۇقى 20bp دىن تۆۋەن بولغاندا: [4 (G + C) +2 (A + T)] - 5 ℃
قەغەزنىڭ ئۇزۇنلۇقى 20bp دىن چوڭ بولغاندا: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / ئۇزۇنلۇق-5 ℃
ئۇنىڭدىن باشقا ، نۇرغۇنلىغان يۇمشاق دېتاللار يەنە قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلىدۇ ، ھېسابلاش پرىنسىپى ئوخشىمايدۇ ، شۇڭا بەزىدە ھېسابلانغان قىممەتتە ئازراق پەرق بولۇشى مۇمكىن.PCR ئىنكاسىنى ئەلالاشتۇرۇش ئۈچۈن ، ئەڭ ياخشى ئۈنۈم ۋە ئېنىقلىق ئۈچۈن تېمپېراتۇرا 54 than دىن تۆۋەن بولماسلىقى كېرەك.
ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، دەسلەپكى قوشۇمچە ئىقتىدارلار ھەر بىر قوشۇمچە يادروغا تۆت ھەسسە ئاشىدۇ ، شۇڭا كۆپىنچە قوللىنىشچان پروگراممىلارنىڭ ئەڭ تۆۋەن دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى 18 يادرو بولىدۇ.دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقنىڭ يۇقىرى چېكى ئانچە مۇھىم ئەمەس ، ئاساسلىقى ئىنكاس ئۈنۈمى بىلەن مۇناسىۋەتلىك.ئېنتىروپىيە سەۋەبىدىن ، پىرىمېر قانچە ئۇزۇن بولسا ، نىشان DNA غا باغلاش نىسبىتى شۇنچە تۆۋەن بولىدۇ ، DNA پولىمېراسىنىڭ باغلىنىشى ئۈچۈن مۇقىم قوش سىزىقلىق قېلىپ شەكىللىنىدۇ.
يۇمشاق دېتالنى ئىشلىتىپ دەسلەپكى لايىھەلىگۈچىلەرنى ئىشلەتكەندە ، پىرىمېرلارنىڭ ئۇزۇنلۇقىنى TM قىممىتى بىلەن بەلگىلىگىلى بولىدۇ ، بولۇپمۇ فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدار PCR ، TM = 60 ℃ ياكى شۇنىڭغا ئوخشاش كونتروللىغۇچنى كونترول قىلىش كېرەك.
2.GC مەزمۇنى
ئادەتتە ، دەسلەپكى قەدەمدىكى G + C نىڭ مەزمۇنى% 40 ~% 60 ، بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ GC مەزمۇنى ۋە Tm قىممىتى ماسلىشىشى كېرەك.ئەگەر پىرىسلاشتا ئېغىر GC ياكى AT يۈزلىنىشى بولسا ، مۇۋاپىق مىقداردىكى A ، T ياكى G ۋە C قۇيرۇقىنى دەسلەپكى 5 نىڭ ئاخىرىغا قوشقىلى بولىدۇ.
3. تېمپېراتۇرا تۆۋەنلەش
تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى زەنجىرسىمان تېمپېراتۇرىدىن 5 ℃ تۆۋەن بولۇشى كېرەك.ئەگەر دەسلەپكى بازا سانى ئاز بولسا ، ئۇلاش تېمپېراتۇرىسىنى مۇۋاپىق ئۆستۈرگىلى بولىدۇ ، بۇ PCR نىڭ خاسلىقىنى ئاشۇرالايدۇ.ئەگەر بازا سانى كۆپ بولسا ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى مۇۋاپىق تۆۋەنلەتكىلى بولىدۇ.4 ℃ ~ 6 of بولغان بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى پەرقى PCR مەھسۇلات مىقدارىغا تەسىر كۆرسەتمەيدۇ ، ئەمما ئەڭ ياخشىسى بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئوخشاش بولۇپ ، 55 ℃ ~ 75 between ئارىسىدا ئوخشىمايدۇ.
4. كېڭەيتىش ئەندىزىسىنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونىدىن ساقلىنىڭ
كۈچەيتىلگەن بۆلەكنى تاللىغاندا قېلىپنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونىدىن ساقلىنىش ئەڭ ياخشى.نىشان بۆلەكنىڭ مۇقىم ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى مۇناسىۋەتلىك كومپيۇتېر يۇمشاق دېتاللىرى مۆلچەرلىگىلى ۋە مۆلچەرلىگىلى بولىدۇ ، بۇ قېلىپنى تاللاشقا پايدىلىق.تەجرىبە نەتىجىسى شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، كېڭەيتىلىدىغان رايوننىڭ ئەركىن ئېنېرگىيىسى (△ G) 58.6lkJ / مولغا يەتمىسە ، كېڭىيىش ھەمىشە مەغلۇپ بولىدۇ.
5. نىشانلىق DNA بىلەن ماسلاشماسلىق
كۈچەيتىلگەن نىشان DNA تەرتىپى چوڭ بولغاندا ، دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ نىشان DNA نىڭ كۆپ قىسىم جايلىرىغا باغلىنىشى مۇمكىن ، نەتىجىدە كۆپ خىل بەلۋاغ پەيدا بولىدۇ.بۇ قېتىم BLAST يۇمشاق دېتال سىنىقى ، توربېكەتنى ئىشلىتىش كېرەك:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.ئىككى تەرتىپنى توغرىلاڭ (bl2seq).
دەسلەپكى تەرتىپنى 1-رايونغا چاپلاش ۋە 2-رايونغا نىشانلانغان DNA تەرتىپىنى ئالماشتۇرۇش ئۆز-ئارا ئالماشتۇرۇلىدۇ ، BLAST تولۇقلاش ، قارشى تۇرۇش ۋە باشقا ئېھتىماللىقلارنى ھېسابلايدۇ ، شۇڭا ئىشلەتكۈچىلەر ھەر ئىككى زەنجىرنىڭ سەزگۈر زەنجىر ياكى ئەمەسلىكىگە دىققەت قىلىشىنىڭ ھاجىتى يوق.سانداندىكى تەرتىپنىڭ GI نومۇرىنى بىلسىڭىز ، GI نومۇرىنىمۇ كىرگۈزەلەيسىز ، شۇڭا تەرتىپنىڭ چوڭ بىر قىسمىنى چاپلاشنىڭ ھاجىتى يوق.ئاخىرىدا ، 3 دە «توغرىلاش» نى چېكىپ ، كۆرسەتكۈچنىڭ نىشان DNA دا كۆپ خىل گومولوگىيىلىك تور بېكەت بار-يوقلۇقىنى بىلىڭ.
6. دەسلەپكى تېرمىنال
پىرىسلاشنىڭ 3 'ئاخىرى كېڭەيتىشنىڭ باشلىنىدىغان يېرى ، شۇڭا ماس كەلمەسلىكنىڭ شۇ يەردىن باشلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.3 'ئاخىرى ئۇدا 3 G ياكى C دىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك ، چۈنكى بۇ G + C بېيىش تەرتىپى رايونىدا خاتالىقنىڭ قوزغىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.3 'ئاخىرى ھېچقانداق ئىككىلەمچى قۇرۇلما ھاسىل قىلالمايدۇ ، پەقەت ئالاھىدە PCR (AS-PCR) ئىنكاسىدىن باشقا ، دەسلەپكى 3 ′ ئاخىرىنى ماسلاشتۇرغىلى بولمايدۇ.مەسىلەن ، كودلاش رايونى كۈچەيتىلگەن بولسا ، 3 'پىرىسلاشنىڭ ئاخىرىنى كودلىغۇچنىڭ ئۈچىنچى ئورنىدا ئاخىرلاشتۇرماسلىق كېرەك ، چۈنكى كودنىڭ ئۈچىنچى ئورنى ئاسانلا بۇزۇلۇپ كېتىدۇ ، بۇ كۈچەيتىشنىڭ كونكرېتلىقى ۋە ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.قوشۇمچە زاپچاسنى ئىشلەتكەندە ، كود ئىشلىتىش جەدۋىلىنى كۆرۈڭ ، بىئولوگىيىلىك ئەۋزەللىككە دىققەت قىلىڭ ، 3 ′ ئۇچىدا قوشۇمچە زاپچاسنى ئىشلەتمەڭ ، ھەمدە قويۇقلۇقى يۇقىرى بولغان پىرىمېر (1uM-3uM) نى ئىشلىتىڭ.
7. پىرىمېرلارنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسى
پىرىمېرلارنىڭ ئۆزىدە قوشۇمچە تەرتىپلەر بولماسلىقى كېرەك ، بولمىسا پىرىزېرلارنىڭ ئۆزى چاچ ياساش قۇرۇلمىسىغا قاتلىنىدۇ ، بۇ ئىككىلەمچى قۇرۇلما ستېرېئولۇق توسالغۇ سەۋەبىدىن ئىپتىدائىي ۋە قېلىپلارنىڭ باغلىنىشىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئەگەر سۈنئىي ھۆكۈم قوللىنىلسا ، پىرىمېرلارنىڭ ئۇدا تولۇقلاش ئاساسى 3bp دىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك.ئىككى خىل پىرىماتور ئوتتۇرىسىدا بىر-بىرىنى تولۇقلاش بولماسلىقى كېرەك ، بولۇپمۇ 3 'ئۇچىنى تولۇقلاشتىن ساقلىنىش كېرەك ، دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقىنىڭ شەكىللىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، بىر جۈپ پىرىمېرنىڭ ئۇدا 4 ئاساسى گومولوگىيە ياكى تولۇقلاش بولماسلىقى كېرەك.
8. بەلگە ياكى ئورۇن قوشۇڭ
5 'ئاخىرىنىڭ كۈچەيتىش ئالاھىدىلىكىگە ئانچە چوڭ تەسىرى يوق ، شۇڭا كېڭەيتىش ئالاھىدىلىكىگە تەسىر كۆرسەتمەيلا ئۆزگەرتىشكە بولىدۇ.Primer 5 'ئاخىرىنى ئۆزگەرتىش ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ: فېرمېنت چەكلەش تور بېكىتى قوشۇشبەلگە قويۇلغان بىئوتىن ، فلۇئورېسسېنسىيە ، دىگوسىن ، Eu3 + قاتارلىقلار ئاقسىلنى باغلايدىغان DNA تەرتىپىنى تونۇشتۇرىدۇ.ئۆزگىرىشچان تور بېكەتلەرنى تونۇشتۇرۇش ، كىرگۈزۈش ۋە يوقاپ كېتىشنىڭ ئۆزگىرىش تەرتىپىنى تونۇشتۇرۇش ۋە تەشۋىقات تەرتىپىنى تونۇشتۇرۇش قاتارلىقلار قوشۇمچە ئاساسلار ئازدۇر-كۆپتۇر كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىپ ، دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقىنىڭ شەكىللىنىش پۇرسىتىنى ئاشۇرىدۇ ، ئەمما كېيىنكى قەدەمدە چوقۇم بەزى ئېتىبارلارنى بېرىش كېرەك.نىشان تەرتىپىدە يوق قوشۇمچە تەرتىپلەر ، مەسىلەن چەكلەش تور بېكىتى ۋە تەشۋىقاتچىلار تەرتىپى ، دەسلەپكى باسقۇچنىڭ 5 ′ ئاخىرىغا كونكرېتلىققا تەسىر كۆرسەتمەيلا قوشقىلى بولىدۇ.بۇ تەرتىپلەر دەسلەپكى Tm قىممىتىنى ھېسابلاشقا كىرگۈزۈلمەيدۇ ، ئەمما تولۇقلاش ۋە ئىچكى ئىككىلەمچى قۇرۇلمىنى سىناش كېرەك.
9. Subclones
كۆپىنچە ۋاقىتلاردا ، PCR پەقەت دەسلەپكى كلونلاش ، ئاندىن بىز نىشان بۆلەكنى ھەر خىل ۋېكتورلارغا بۆلۈشىمىز كېرەك ، شۇڭا PCR باسقۇچىدىكى كېيىنكى مەشغۇلات ئۈچۈن قوشۇمچە بازا لايىھىلەپ چىقىشىمىز كېرەك.
كىچىكلىتىش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن بەزى تەرتىپلەر تۆۋەندە يىغىنچاقلاندى.
چەكلەش چەكلىمىسى تور بېكىتى قوشۇلدى
فېرمېنت چەكلەش تور بېكەتلىرىنى قوشۇش PCR مەھسۇلاتلىرىنى كىچىكلىتىشتە ئەڭ كۆپ قوللىنىلىدىغان ئۇسۇل.ئادەتتە ، تازىلاش مەيدانى ئالتە بازا بولۇپ ، تازىلاش مەيدانىنىڭ 5 'ئۇچىدىن باشقا ، 2 ~ 3 قوغداش بازىسى قوشۇشى كېرەك.قانداقلا بولمىسۇن ، ئوخشىمىغان فېرمېنتلار تەلەپ قىلىدىغان قوغداش بازىسىنىڭ سانى ئوخشىمايدۇ.مەسىلەن ، SalⅠ ھېچقانداق قوغداش بازىسى تەلەپ قىلمايدۇ ، EcoRⅤ 1 قوغداش بازىسى ، NotⅠ 2 قوغداش بازىسى ، Hind 3 3 قوغداش بازىسى تەلەپ قىلىدۇ.
LIC قۇيرۇقنى قوشىدۇ
LIC نىڭ تولۇق ئىسمى Ligation- مۇستەقىل كلونلاش ، Navogen تەرىپىدىن PET ۋېكتورىنىڭ بىر قىسمى ئۈچۈن كەشىپ قىلغان كلونلاش ئۇسۇلى.LIC ئۇسۇلى بىلەن تەييارلانغان PET توشۇغۇچىنىڭ تولۇقلىمايدىغان 12-15 ئاساسى يەككە تاياقچە يېپىشقاق ئۇچى بار ، بۇ نىشان قىستۇرما پارچىغا ماس كېلىدىغان يېپىشقاق ئۇچىنى تولۇقلايدۇ.كۈچەيتىش مەقسىتىدە ، قىستۇرۇلغان بۆلەكنىڭ دەسلەپكى 5 ′ تەرتىپى LIC ۋېكتورنى تولۇقلىشى كېرەك.T4 DNA پولىمېراسىنىڭ 3 ′ → 5 ′ قوشۇمچە پائالىيىتى قىسقا ۋاقىتتىن كېيىن قىستۇرۇلغان پارچىدا يەككە تال تاياقچە شەكىل ھاسىل قىلالايدۇ.بۇ مەھسۇلات پەقەت تەييارلانغان قىستۇرما بۆلەك بىلەن ۋېكتورنىڭ ئۆز-ئارا باغلىنىشىدىن ھاسىل بولغانلىقتىن ، بۇ ئۇسۇل ناھايىتى تېز ۋە ئۈنۈملۈك بولۇپ ، ئۇ كلونلاشقا يېتەكلىنىدۇ.
يۆنىلىشلىك TA كلون قۇيرۇق قوشىدۇ
TA كلونلاش بۇ بۆلەكنى ۋېكتورغا نىشانلىيالمىدى ، شۇڭا كېيىن Invitrogen كلونلاشنى نىشانلىيالايدىغان ۋېكتورنى تونۇشتۇردى ، ئۇنىڭدا بىر ئۇچىدا تۆت داڭلىق GTGGS بار.شۇڭلاشقا PCR دەسلەپكى لايىھەلىگۈچىلەرگە ماس ھالدا قوشۇمچە تەرتىپلەرنى قوشۇش كېرەك ، بۇنداق بولغاندا پارچىلار «يۆنىلىشلىك» بولىدۇ.
ئەگەر ۋاقتىڭىز قىسقا بولسا ، بىۋاسىتە بىرىكتۈرۈشنى سىناپ باقسىڭىز بولىدۇ ، گېن بىلەن ۋېكتورنى بىرلەشتۈرەلەيسىز ، بۇ بىز مۇسكۇل مۇسكۇلىدىكى ET گېن بىرىكمىسى دەپ ئاتايمىز.
D. In-Fusion كلونلاش ئۇسۇلى
لەگلەك تەلەپ قىلىنمايدۇ ، ئۇزۇن ئىنكاس تەلەپ قىلىنمايدۇ.سىزىقلىق ۋېكتورنىڭ ئىككى ئۇچىدىكى تەرتىپ ئوتتۇرىغا قويۇلسىلا ، دەسلەپكى لايىھىلەشتە ، ئاندىن PCR مەھسۇلاتى ۋە سىزىقلىق ۋېكتور BSA بولغان بىرىكتۈرۈلگەن ئېنزىم ئېرىتمىسىگە قوشۇلۇپ ، يېرىم سائەت ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا قويۇلسا ، ئۆزگەرتىش ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.بۇ ئۇسۇل چوڭ ھەجىمدىكى ئايلاندۇرۇشقا ئالاھىدە ماس كېلىدۇ.
10. قەغەزنى بىرلەشتۈرۈش
بەزىدە ، دەسلەپكى لايىھىلەش ھەققىدە پەقەت چەكلىك تەرتىپ ئۇچۇرلىرىلا بىلىنىدۇ.مەسىلەن ، پەقەت ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ تەرتىپىلا بىلىنسە ، بىرلەشتۈرۈش قەغىزى لايىھىلىگىلى بولىدۇ.بىرلەشتۈرۈش قەغىزى ئوخشىمىغان تەرتىپلەرنىڭ ئارىلاشمىسى بولۇپ ، يەككە ئامىنو كىسلاتاسىنى كودلاشتۇرىدىغان ئوخشىمىغان ئاساسى مۇمكىنچىلىكلەرگە ۋەكىللىك قىلىدۇ.كونكرېتلىقنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، كود ئىشلىتىش جەدۋىلىنى ئىشلىتىپ ، ئوخشىمىغان جانلىقلارنىڭ ئاساسى ئىشلىتىش ئەۋزەللىكىگە ئاساسەن قوشۇمچە قىلىشنى ئازايتسىڭىز بولىدۇ.Hypoxanthine نى بارلىق ئاساسلار بىلەن ماسلاشتۇرۇپ ، پىرىمېرنىڭ ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى تۆۋەنلەتكىلى بولىدۇ.پىرىسلاشنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى قوشۇمچە بازىنى ئىشلەتمەڭ ، چۈنكى ئاخىرقى 3 بازىنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى ئۇلىنىشى PCR نى خاتا جايدا قوزغىتىشقا يېتىدۇ.تېخىمۇ كۆپ دەسلەپكى قويۇقلۇق دەرىجىسى (1μM دىن 3μMM) ئىشلىتىلىدۇ ، چۈنكى نۇرغۇن قوشۇمچە ئارىلاشمىلاردىكى پىرىسلار نىشان قېلىپىغا خاس ئەمەس.
PCR خام ئەشياسىكونترول
1. دەسلەپكى مىقدار
ھەر بىر قەغەزنىڭ قويۇقلۇقى 0.1 ~ 1umol ياكى 10 ~ 100pmol.تەلەپ قىلىنغان نەتىجىنى ئەڭ تۆۋەن مىقداردا ئىشلەپچىقارغان ياخشى.پىرىمېرنىڭ قويۇقلۇقى يۇقىرى ماسلاشماسلىق ۋە كونكرېت كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ھەمدە پىرىمېرلار ئارىسىدا ۋاقىت شەكىللەندۈرۈش پۇرسىتىنى ئاشۇرىدۇ.
2. دەسلەپكى قويۇقلۇقى
پىرىمېرلارنىڭ قويۇقلۇقى كونكرېتلىققا تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئەڭ ياخشى دەسلەپكى قويۇقلۇقى ئادەتتە 0.1 دىن 0.5μM ئارىلىقىدا بولىدۇ.يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى قويۇقلۇقى ئەھمىيەتسىز مەھسۇلاتلارنىڭ كۈچىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
3. پىرىسلاشنىڭ تېمپېراتۇرىسى
پىرىمېرلارنىڭ يەنە بىر مۇھىم پارامېتىرى ئېرىتىش تېمپېراتۇرىسى (Tm).بۇ تېمپېراتۇرا% 50 پىرىمېر ۋە قوشۇمچە تەرتىپلەر قوش لىنىيىلىك DNA مولېكۇلاسى سۈپىتىدە ئىپادىلەنگەندە.PCR ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى تەڭشەش ئۈچۈن Tm تەلەپ قىلىنىدۇ.ئەڭ ياخشىسى ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى تۆۋەن بولۇپ ، نىشانلارنىڭ تەرتىپلىك ھالدا ئۈنۈملۈك ئۇلىنىشىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ ، ئەمما ئەھمىيەتسىز باغلىنىشنى ئازايتقىلى بولىدۇ.مۇۋاپىق تېمپېراتۇرا 55 55 تىن 70 ℃.تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئادەتتە Tm دەسلەپكى كۆرسەتكۈچتىن 5 ℃ تۆۋەن بولىدۇ.
Tm نى تەڭشەشنىڭ بىر قانچە فورمۇلاسى بار ، بۇلار ئىشلىتىلگەن فورمۇلا ۋە پىرىمېرلارنىڭ تەرتىپىگە ئاساسەن ئوخشىمايدۇ.كۆپىنچە فورمۇلالار مۆلچەرلەنگەن Tm قىممىتى بىلەن تەمىنلەيدىغان بولغاچقا ، بارلىق تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى پەقەت بىر باشلىنىش نۇقتىسى.ماسلىشىشچان تېمپېراتۇرىنى تەدرىجىي ئۆرلىتىدىغان بىر قانچە ئىنكاسلارنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق كونكرېتلىقنى ياخشىلىغىلى بولىدۇ.مۆلچەردىكى Tm-5 below دىن باشلاڭ ، ھەمدە ئاستا-ئاستا 2 an ئۆرلەش تېمپېراتۇرىسىنى ئۆرلىتىڭ.يۇقىرى تېمپېراتۇرا يۇقىرى تېمپېراتۇرا ۋە ئالاھىدە بولمىغان مەھسۇلاتلارنىڭ شەكىللىنىشىنى ئازايتىدۇ.ئەڭ ياخشى نەتىجىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ، بۇ ئىككى دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ Tm قىممىتى بولۇشى كېرەك.ئەگەر دەسلەپكى جۈپلەرنىڭ Tm پەرقى 5 than دىن ئېشىپ كەتسە ، پىرىمېرلار دەۋرىيلىكتە تۆۋەن تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى ئىشلىتىپ كۆرۈنەرلىك يالغان باشلىنىشنى كۆرسىتىدۇ.ئەگەر ئىككى خىل دەسلەپكى Tm ئوخشىمىسا ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى ئەڭ تۆۋەن Tm دىن 5 ℃ تۆۋەنگە تەڭشەڭ.ئۇنىڭدىن باشقا ، كونكرېتلىقنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، ئالدى بىلەن تېخىمۇ يۇقىرى Tm ئۈچۈن لايىھەلەنگەن قوشۇمچە تېمپېراتۇرىدا بەش دەۋرىيلىكنى ، ئاندىن قالغان دەۋرىيلىكلەرنى تۆۋەن Tm ئۈچۈن لايىھەلەنگەن قوشۇمچە تېمپېراتۇرىدا ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.بۇ مەنزىل قېلىپىنىڭ قىسمەن نۇسخىسىنى قاتتىق شارائىتتا ئېرىشكىلى بولىدۇ.
4. دەسلەپكى ساپلىق ۋە مۇقىملىق
كۆپىنچە PCR قوللىنىشچان پروگراممىلىرىنىڭ ئۆلچەملىك ساپلىقى يېتەرلىك.بېنزويل ۋە ئىزوبۇتېل گۇرۇپپىسىنى تۇزسىزلاندۇرۇش ئارقىلىق ئېلىۋېتىش ناھايىتى ئاز ، شۇڭا PCR غا دەخلى قىلمايدۇ.بەزى قوللىنىشچان پروگراممىلار بىرىكتۈرۈش جەريانىدا تولۇق بولمىغان تەرتىپلەرنى ئۆچۈرۈۋېتىشنى تەلەپ قىلىدۇ.بۇ قىسقارتىلغان تەرتىپلەر DNA بىرىكتۈرۈش خىمىيىسىنىڭ ئۈنۈمى% 100 بولمىغاچقا يۈز بېرىدۇ.بۇ ئايلانما جەريان بولۇپ ، قايتا-قايتا خىمىيىلىك رېئاكسىيە ئىشلىتىدۇ ، چۈنكى ھەر بىر بازا قوشۇلۇپ 3 ′ دىن 5 ′ گىچە بولىدۇ.ھەر ئىككى دەۋرىدە مەغلۇپ بولىسىز.ئۇزۇنراق پىرىمېرلار ، بولۇپمۇ 50 دىن يۇقىرى بازىلارنىڭ كېسىلگەن تەرتىپلىرى كۆپ بولۇپ ، ساپلاشتۇرۇشنى تەلەپ قىلىشى مۇمكىن.
پىرىمېرلارنىڭ مەھسۇلات مىقدارى بىرىكمە خىمىيىلىك ۋە ساپلاشتۇرۇش ئۇسۇلىنىڭ تەسىرىگە ئۇچرايدۇ.Cytology ۋە Shengong غا ئوخشاش بىئولوگىيىلىك دورا شىركەتلىرىنىڭ ھەممىسى ئەڭ تۆۋەن OD بىرلىكى ئىشلىتىپ ، ئولىگونوكلېئوسىدنىڭ ئومۇمىي مەھسۇلات مىقدارىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ.ئىختىيارى پىرىسلار قۇرۇق پاراشوك شەكلىدە توشۇلىدۇ.ئەڭ ياخشىسى TE دىكى پىرىمېرلارنى قايتا ئېرىتىپ ، ئەڭ ئاخىرقى قويۇقلۇقى 100μM بولىدۇ.TE دىئونسىزلانغان سۇدىن ياخشى ، چۈنكى سۇنىڭ pH ھەمىشە كىسلاتالىق بولۇپ ، ئولىگونۇكلېئوسىدلارنىڭ گىدرولىزلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
پىرىمېرلارنىڭ مۇقىملىقى ساقلاش شارائىتىغا باغلىق.قۇرۇق پاراشوك ۋە ئېرىتىلگەن پىرىماتلارنى -20 at ساقلاش كېرەك.10MM دىن يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى TE دا ئېرىتىلگەن پىرىمېرلار -20 at دە 6 ئاي مۇقىم ساقلىغىلى بولىدۇ ، ئەمما ئۆي تېمپېراتۇرىسى (15 ℃ 30 ℃) غىچە 1 ھەپتەغىمۇ يەتمەيدۇ.قۇرۇق پاراشوك پىرىسلاش -20 سېلسىيە گرادۇستا كەم دېگەندە 1 يىل ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (15 سېلسىيە گرادۇستىن 30 سېلسىيە گرادۇسقىچە) 2 ئاي ساقلىغىلى بولىدۇ.
5. ئېنزىم ۋە ئۇلارنىڭ قويۇقلۇقى
ھازىر ئىشلىتىلگەن Taq DNA پولىمېراسى ئاساسەن چوڭ ئۈچەي باكتېرىيەسى تەرىپىدىن بىرىكتۈرۈلگەن گېن قۇرۇلۇش ئېنزىم.تىپىك PCR ئىنكاسىنى قوزغىتىش ئۈچۈن كېرەكلىك ئېنزىمنىڭ مىقدارى تەخمىنەن 2.5U (ئومۇمىي رېئاكسىيە مىقدارى 100ul نى كۆرسىتىدۇ).ئەگەر قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى بولسا ، ئۇ ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئەگەر قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا ، بىرىكمە مەھسۇلاتنىڭ مىقدارى ئازىيىدۇ.
6. DNTP نىڭ سۈپىتى ۋە قويۇقلۇقى
DNTP نىڭ سۈپىتى PCR كۈچەيتىشنىڭ قويۇقلۇقى ۋە ئۈنۈمى بىلەن زىچ مۇناسىۋەتلىك.DNTP پاراشوكى دانچە بولۇپ ، نامۇۋاپىق ساقلانسا ئۇنىڭ ئۆزگىرىشچانلىقى بىئولوگىيىلىك پائالىيىتىنى يوقىتىدۇ.DNTP ئېرىتمىسى كىسلاتالىق بولۇپ ، يۇقىرى قويۇقلۇقتا ئىشلىتىش كېرەك ، 1M NaOH ياكى 1M Tris.كۆپ توڭلىتىش ئېرىتىش DNTP نى تۆۋەنلىتىدۇ.PCR ئىنكاسىدا ، DNTP 50 ~ 200umol / L بولۇشى كېرەك.بولۇپمۇ تۆت DNTPS نىڭ قويۇقلۇقىغا دىققەت قىلىش كېرەك.ئەگەر ئۇلارنىڭ بىرىنىڭ قويۇقلۇقى باشقىلاردىن پەرقلەنسە (يۇقىرى ياكى تۆۋەن) ، ماسلاشماسلىق كېلىپ چىقىدۇ.قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى تۆۋەنلىتىدۇ.DNTP Mg2 + بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ھەقسىز Mg2 + نىڭ قويۇقلۇقىنى ئازايتالايدۇ.
7. قېلىپ (نىشان گېنى) يادرو كىسلاتاسى
قېلىپ يادرو يادروسىنىڭ مىقدارى ۋە ساپلاشتۇرۇش دەرىجىسى PCR نىڭ مۇۋەپپەقىيەت قازىنىشى ياكى مەغلۇپ بولۇشىدىكى مۇھىم ھالقىلارنىڭ بىرى.ئەنئەنىۋى DNA تازىلاش ئۇسۇللىرى ئادەتتە SDS ۋە ئاقسىل K نى ئىشلىتىپ ئەۋرىشكە ھەزىم قىلىدۇ ۋە بىر تەرەپ قىلىدۇ.SDS نىڭ ئاساسلىق رولى: ھۈجەيرە پەردىسىدىكى ياغ ۋە ئاقسىلنى ئېرىتىپ ، شۇ ئارقىلىق پەردى ئاقسىلىنى ئېرىتىپ ھۈجەيرە پەردىسىنى بۇزىدۇ ۋە ھۈجەيرىدىكى يادرو ئاقسىلىنى پارچىلايدۇ ، SDS يەنە ئاقسىل بىلەن بىرىكىپ چۆكەلەيدۇ.ئاقسىل K ئاقسىلنى ھىدرولىزلىيالايدۇ ۋە ھەزىم قىلالايدۇ ، بولۇپمۇ DNA بىلەن باغلانغان گىستوننى ئىشلىتەلەيدۇ ، ئاندىن ئورگانىك ئېرىتكۈچى فېنول ۋە خلوروفورم ئارقىلىق ئاقسىل ۋە باشقا ھۈجەيرە تەركىبلىرىنى ئايرىيالايدۇ ، ئېتانول ياكى ئىزوپروپىل ئىسپىرتلىرىنى ئىشلىتىپ يادرو كىسلاتاسىنى چۆكتۈرەلەيدۇ.ئېلىنغان يادرو كىسلاتاسىنى PCR ئىنكاسىنىڭ قېلىپى قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدۇ.ئادەتتىكى كلىنىكىلىق بايقاش ئەۋرىشكىسىگە نىسبەتەن ، تېز ۋە ئاددىي ئۇسۇل ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنى ئېرىتىش ، كېسەللىك قوزغاتقۇچىنى لىماتلاش ، خروموسومدىن ئاقسىلنى ھەزىم قىلىش ۋە چىقىرىپ تاشلاپ ، نىشانلىق گېنغا ئىشلىتىشكە بولىدۇ ھەمدە PCR كېڭەيتىشكە بىۋاسىتە ئىشلىتىلىدۇ.RNA قېلىپىنى چىقىرىشتا ئادەتتە گانىدىن ئىزوتىئوكيانات ياكى ئاقسىل K ئۇسۇلى قوللىنىلىپ ، RNase نىڭ RNA نىڭ ناچارلىشىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
8.Mg2 + قويۇقلۇقى
Mg2 + PCR كېڭەيتىشنىڭ كونكرېتلىقى ۋە ھوسۇلىغا كۆرۈنەرلىك تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئادەتتە PCR ئىنكاسىدا ، ھەر خىل DNTP نىڭ قويۇقلۇقى 200umol / L بولغاندا ، Mg2 + نىڭ مۇۋاپىق قويۇقلۇقى 1.5 ~ 2.0mmol / L.Mg2 + نىڭ قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى ، رېئاكسىيەنىڭ ئالاھىدىلىكى تۆۋەنلەيدۇ ، كونكرېت كۈچەيتمەسلىك يۈز بېرىدۇ ، بەك تۆۋەن قويۇقلۇق دەرىجىسى Taq DNA پولىمېراسىنىڭ پائالىيىتىنى تۆۋەنلىتىدۇ ، نەتىجىدە ئىنكاس مەھسۇلاتلىرىنىڭ ئازىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
ماگنىي ئىئونى PCR نىڭ بىر قانچە تەرەپلىرىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ ، مەسىلەن DNA پولىمېرازا پائالىيىتى ، مەھسۇلاتقا تەسىر كۆرسىتىدۇ.يەنە بىر مىسال دەسلەپكى قەدەمدە باغلىنىش بولۇپ ، ئۇ كونكرېتلىققا تەسىر كۆرسىتىدۇ.DNTP ۋە قېلىپ ماگنىي ئىئونىغا باغلىنىپ ، فېرمېنت پائالىيىتىگە ئېھتىياجلىق ھەقسىز ماگنىي ئىئونىنىڭ مىقدارىنى ئازايتىدۇ.ئەڭ ياخشى ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى ئوخشىمىغان دەسلەپكى جۈپلەر ۋە قېلىپلاردا ئوخشىمايدۇ ، ئەمما تىپىك PCR نىڭ قويۇقلۇقى 200μM dNTP بىلەن 1.5mM (ئەسكەرتىش: ھەقىقىي مىقداردىكى PCR ئۈچۈن ، فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن 3 5 5MM ماگنىي ئىئون ئېرىتمىسىنى ئىشلىتىڭ).ئەركىن ماگنىي ئىئونىنىڭ قويۇقلۇقى يۇقىرى بولسا ھوسۇلنى ئاشۇرىدۇ ، ئەمما ئەھمىيەتسىز كۈچەيتىشنى ئاشۇرۇپ ، ساداقەتنى تۆۋەنلىتىدۇ.ئەڭ ياخشى قويۇقلۇقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، ماگنىي ئىئونىنىڭ ماۋزۇسى 0.5mM دىن 1mM دىن 3mM غىچە كۆپەيتىلدى.ماگنىي ئىئونىنى ئەلالاشتۇرۇشقا تايىنىشنى ئازايتىش ئۈچۈن ، پىلاتىنا DNA DNA پولىمېراسىنى ئىشلەتكىلى بولىدۇ.پىلاتىنا Taq DNA پولىمېراسى Taq DNA پولىمېراسىغا قارىغاندا تېخىمۇ كەڭ دائىرىدىكى ماگنىي ئىئون قويۇقلۇقىدا ئىقتىدارنى ساقلاپ قالالايدۇ ، شۇڭا ئەلالاشتۇرۇشنى تەلەپ قىلىدۇ.
9. Pcr تەشۋىق قىلىدىغان خۇرۇچلار
كۆپىنچە قېلىپلارنىڭ يۇقىرى دەرىجىدىكى كۈچەيتىلىشى ئۈچۈن قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى ئەلالاشتۇرۇش ، دەسلەپكى لايىھە ۋە ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى يېتەرلىك.قانداقلا بولمىسۇن ، GC ئەندىزىسى يۇقىرى بولغان بەزى قېلىپلار قوشۇمچە تەدبىرلەرنى تەلەپ قىلىدۇ.DNA نىڭ ئېرىش تېمپېراتۇرىسىغا تەسىر قىلىدىغان خۇرۇچلار مەھسۇلاتنىڭ ئالاھىدىلىكى ۋە مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرۇشنىڭ يەنە بىر ئۇسۇلى بىلەن تەمىنلەيدۇ.ئەڭ ياخشى نەتىجىگە ئېرىشىش ئۈچۈن قېلىپنى تولۇق ئايرىش تەلەپ قىلىنىدۇ.
ئۇنىڭدىن باشقا ، ئىككىلەمچى قۇرۇلما دەسلەپكى باغلىنىش ۋە فېرمېنتنىڭ كېڭىيىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
PCR خۇرۇچلىرى فورمامىد ، DMSO ، گلىتسېرىن ، بىتائىن ۋە PCRx كۈچەيتكۈچ ھەل قىلىش لايىھىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.ئۇلارنىڭ مۇمكىنچىلىكى بولغان مېخانىزم ئېرىتىش تېمپېراتۇرىسىنى تۆۋەنلىتىش ، بۇنىڭ بىلەن پىرىمېرلارنىڭ ئۇلىنىشىغا ياردەم بېرىش ۋە ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونى ئارقىلىق DNA پولىمېرازىنىڭ كېڭىيىشىگە ياردەم بېرىش.PCRx Solution نىڭ باشقا ئارتۇقچىلىقلىرى بار.Platinum Taq DNA polymerase ۋە Platinum Pfx DNA polymerase نى ئىشلەتكەندە ئەڭ تۆۋەن ماگنىي ئىئونىنى ئەلالاشتۇرۇش تەلەپ قىلىنىدۇ.شۇڭا ، پىلاتىنا تېخنىكىسى خۇرۇچ بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئۈچىنچى خىل ئۇسۇلنىڭ تايىنىشچانلىقىنى تۆۋەنلىتىش بىلەن بىللە ، ماگنىي ئىئونىنى ئەلالاشتۇرۇش.ئەڭ ياخشى ئۈنۈمگە ئېرىشىش ئۈچۈن ، خۇرۇچلارنىڭ قويۇقلۇقىنى ئەلالاشتۇرۇش كېرەك ، بولۇپمۇ DMSO ، فورمامىد ۋە گلىتسېرىن ، ئۇلار DNA DNA پولىمېراسىنى چەكلەيدۇ.
10. قىزىق باشلىنىش
قىزىق باشلاش PCR ياخشى دەسلەپكى لايىھىلەشتىن باشقا ، PCR خاسلىقىنى ياخشىلاشتىكى ئەڭ مۇھىم ئۇسۇللارنىڭ بىرى.گەرچە Taq DNA پولىمېراسىنىڭ ئەڭ ياخشى ئۇزارتىش تېمپېراتۇرىسى 72 بولسىمۇ ، ئەمما پولىمېرازا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا يەنىلا ئاكتىپ ھالەتتە تۇرىدۇ.شۇڭا ، PCR رېئاكسىيەسىنى تەييارلاش ۋە ئىسسىقلىق دەۋرىيلىكىنىڭ بېشىدا ساقلاش تېمپېراتۇرىسى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىدىن تۆۋەن بولغاندا ئىشلەپچىقىرىلىدۇ.شەكىللەنگەندىن كېيىن ، بۇ ئەھمىيەتسىز مەھسۇلاتلار ئۈنۈملۈك كۈچەيتىلىدۇ.دەسلەپكى لايىھىلەشتە ئىشلىتىلىدىغان تور بېكەتلەر گېن ئېلېمېنتلىرىنىڭ ئورنى بىلەن چەكلەنسە ، قىزىق نۇقتا PCR ئالاھىدە ئۈنۈملۈك بولىدۇ ، مەسىلەن تور بېكەت يۆنىلىشىدىكى ئۆزگىرىش ، ئىپادىلەش كلونلاش ياكى DNA قۇرۇلۇشىغا ئىشلىتىلىدىغان گېن ئېلېمېنتلىرىنى ياساش ۋە كونترول قىلىش دېگەندەك.
تاق DNA پولىمېراسىنىڭ پائالىيىتىنى چەكلەيدىغان ئورتاق ئۇسۇل ، PCR رېئاكسىيە ئېرىتمىسىنى مۇز ئۈستىدە تەييارلاپ ، قىزىغان PCR ئۈسكۈنىسىگە قويۇش.بۇ ئۇسۇل ئاددىي ھەم ئەرزان ، ئەمما ئۇ فېرمېنتنىڭ پائالىيىتىنى تاماملىمايدۇ ، شۇڭا ئالاھىدە بولمىغان مەھسۇلاتلارنىڭ كۈچەيتىلىشىنى پۈتۈنلەي يوقىتالمايدۇ.
ئىسسىقلىق تارقىتىش PCR ئۈسكۈنىسى ئايرىش تېمپېراتۇرىسىغا يەتكۈچە مۇھىم تەركىبنى چەكلەش ئارقىلىق DNA بىرىكمىسىنى كېچىكتۈرىدۇ.كۆپىنچە قولدا ئىسسىقلىق قوزغىتىش ئۇسۇللىرى ، جۈملىدىن تاق DNA پولىمېراسىنى قوشۇشنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بولۇپمۇ يۇقىرى ئۈنۈملۈك قوللىنىشچان پروگراممىلار ئۈچۈن ئاۋارىچىلىق.باشقا ئىسسىقلىق بىلەن تەمىنلەش ئۇسۇللىرى موم قالقىنى ئىشلىتىپ ماگنىي ئىئونى ياكى فېرمېنتنى ئۆز ئىچىگە ئالغان موھىم تەركىبلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ياكى قېلىپ ۋە بۇففېر قاتارلىق رېئاكتىپ تەركىبلەرنى فىزىكىلىق ئايرىۋېتىدۇ.ئىسسىقلىق دەۋرىدە ھەر خىل زاپچاسلار قويۇپ بېرىلىپ ، موم ئېرىپ كېتىدۇ.قولدا قىزىتىش باشلاش ئۇسۇلىغا ئوخشاش ، موم قالقان ئۇسۇلى ئاۋارىچىلىق ۋە ئاسان بۇلغىنىش بولۇپ ، يۇقىرى كىرگۈزۈش قوللىنىشچان پروگراممىلىرىغا ماس كەلمەيدۇ.
پىلاتىنا DNA پولىمېراسى ئاپتوماتىك قوزغىتىش PCR ئۈچۈن قۇلايلىق ۋە ئۈنۈملۈك.پىلاتىنا تاق DNA پولىمېراسى قايتا ھاسىل بولىدىغان تاق DNA پولىمېراسىدىن تەركىب تاپقان بولۇپ ، تاق DNA پولىمېراسىغا قارشى يەككە ئانتىتېلا بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن.ئانتىتېلا PCR تەرىپىدىن ئۇزۇن مۇددەت تېمپېراتۇرا ساقلاش جەريانىدا ئېنزىم ھەرىكىتىنى چەكلەش ئۈچۈن تۈزۈلگەن.تاق DNA پولىمېراسى 94 ℃ ئايرىش باسقۇچىدىكى ئىزولياتورلۇق جەريانىدا رېئاكسىيەگە قويۇپ بېرىلىپ ، تولۇق پولىمېرازا پائالىيىتى ئەسلىگە كەلدى.ئىسسىقلىق بىلەن قوزغىتىلغان خىمىيىلىك ئۆزگەرتىلگەن تاق DNA پولىمېراسىغا سېلىشتۇرغاندا ، پىلاتىنا فېرمېنتى پولىمېرازا ئاكتىپلاش ئۈچۈن 94 ℃ (10 مىنۇتتىن 15 مىنۇتقىچە) ئۇزۇن ۋاقىت ئىزولياتورلۇق قىلىشنى تەلەپ قىلمايدۇ.PlatinumTaq DNA پولىمېراسى بىلەن ،% 90 تاك DNA پولىمېرا پائالىيىتى 94 مىنۇتتا 2 مىنۇتتىن كېيىن ئەسلىگە كەلگەن.
11. Nest-PCR
ئۇۋىسى پىرىسلانغاندىن كېيىن ئارقا-ئارقىدىن كۈچەيتكۈچ خاسلىق ۋە سەزگۈرلۈكنى ئۆستۈرىدۇ.بىرىنچى ئايلانما 15 دىن 20 دەۋرىيلىكنىڭ ئۆلچەملىك كۈچەيتىلىشى.دەسلەپكى كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ ئاز بىر قىسمى 100 دىن 1000 قېتىمغىچە سۇيۇلدۇرۇلدى ۋە ئىككىنچى باسقۇچلۇق كېڭەيتىشكە 15 دىن 20 ئايغىچە قوشۇلدى.ئۇنىڭدىن باشقا ، دەسلەپكى كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنى گېلى ساپلاشتۇرۇش ئارقىلىق چوڭايتقىلى بولىدۇ.ئۇۋىسى قەغىزى ئىككىنچى باسقۇچلۇق كېڭەيتىشتە ئىشلىتىلىدۇ ، ئۇ بىرىنچى قەغەزنىڭ ئىچىدىكى نىشان تەرتىپىگە باغلىنالايدۇ.ئۇۋىسى PCR نىڭ ئىشلىتىلىشى كۆپ خىل نىشان تور بېكەتلىرىنىڭ كېڭەيتىش ئېھتىماللىقىنى تۆۋەنلىتىدۇ ، چۈنكى ھەر ئىككى يۈرۈش پىرىسلىغۇچنى تولۇقلايدىغان نىشان تەرتىپلىرى ئاز.ئوخشاش پىرىمېر بىلەن ئوخشاش ئومۇمىي دەۋرىيلىك سانى (30 دىن 40 كىچە) ئەھمىيەتسىز تور بېكەتلەرنى كۈچەيتتى.ئۇلانغان PCR چەكلىك نىشان تەرتىپىنىڭ سەزگۈرلۈكىنى ئاشۇرىدۇ (مەسىلەن ، ئاز ئۇچرايدىغان mrnas) ۋە قىيىن PCRS نىڭ خاسلىقىنى ئۆستۈرىدۇ (مەسىلەن 5 ′ RACE).
12. تۆۋەنلەۋاتقان PCR
PCR نىڭ تۆۋەنلىشى PCR نىڭ دەسلەپكى بىر قانچە دەۋرىيلىكى ئۈچۈن قاتتىق ئۇلىنىش شارائىتىنى ئىشلىتىپ خاسلىقنى ياخشىلايدۇ.دەۋرىيلىنىش مۆلچەردىكى Tm دىن تەخمىنەن 5 ℃ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا باشلىنىدۇ ، ئاندىن ھەر بىر دەۋرىيلىنىش تېمپېراتۇرىسى Tm 5 below دىن تۆۋەن بولغۇچە 1 ℃ 2 is تۆۋەنلەيدۇ.پەقەت ئەڭ يۇقىرى گومولوگىيەلىك مەنزىل قېلىپى كۈچەيتىلىدۇ.بۇ مەھسۇلاتلار كېيىنكى دەۋرىيلىكتە داۋاملىق كېڭىيىپ ، كۈچەيتىلگەن ئەھمىيەتسىز مەھسۇلاتلارنى توپلايدۇ.PCR نىڭ تۆۋەنلىشى دەسلەپكى ۋە نىشان قېلىپنىڭ گومولوگىيە دەرىجىسى ئېنىقلانمىغان ئۇسۇللارغا پايدىلىق ، مەسىلەن AFLP DNA بارماق ئىزى.
مۇناسىۋەتلىك PCR يۈرۈشلۈكلىرى
2 × PCR قەھرىمانىTMئارىلاشما سىستېمىنىڭ PCR چەكلىگۈچكە بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارى ئادەتتىكى PCR ئارىلاش سىستېمىسىغا قارىغاندا يۇقىرى بولۇپ ، ھەرخىل مۇرەككەپ قېلىپلارنىڭ PCR كۈچەيتىلىشىگە ئاسانلا تاقابىل تۇرالايدۇ.ئۆزگىچە ئىنكاس سىستېمىسى ۋە يۇقىرى ئۈنۈملۈك تاق قەھرىمان PCR ئىنكاسىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى ، خاسلىقى ۋە سەزگۈرلۈكىنى تېخىمۇ يۇقىرى قىلىدۇ.
تېخىمۇ يۇقىرى كېڭەيتىش ئۈنۈمى
ئۇنىڭدا 5 '→ 3' DNA پولىمېرازا پائالىيىتى ۋە 5 '→ 3' تاشقى كۆرۈنۈش پائالىيىتى بار ، 3 '→ 5' ئېكولوگىيىلىك پائالىيەت يوق.
ھەقىقىي ۋاقىت PCR Easyᵀᴹ-SYBR يېشىل I Kit
كونكېرت - ئەلالاشتۇرۇلغان بۇففېر ۋە قىزىق قوزغىتىش Taq فېرمېنتى ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىك ۋە دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقىنىڭ شەكىللىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ
يۇقىرى سەزگۈرلۈك - تۆۋەن نۇسخىدىكى قېلىپنى بايقىيالايدۇ
بۇ زاپچاسقا ئۆزگىچە Foregene تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكتورى ۋە Foregene HotStar Taq DNA پولىمېراسى ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئۆزگىچە ئىنكاس سىستېمىسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئىنكاسنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى ۋە ئالاھىدىلىكىنى ئۈنۈملۈك ئۆستۈرىدۇ.
يوللانغان ۋاقتى: 5-مايدىن 09-2023-يىلغىچە
