مولېكۇلاغا دىئاگنوز قويۇش تېخنىكىسى مولېكۇلا بىئولوگىيە ئۇسۇلىنى ئىشلىتىپ ، ئادەم بەدىنى ۋە ھەر خىل كېسەللىك قوزغاتقۇچىلارنىڭ گېن ماتېرىيالىنىڭ ئىپادىلىنىشى ۋە قۇرۇلمىسىنى بايقايدۇ ، شۇڭا كېسەللىكلەرنى ئالدىن پەرەز قىلىش ۋە دىئاگنوز قويۇش مەقسىتىگە يېتىدۇ.

يېقىنقى يىللاردىن بۇيان ، مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇش تېخنىكىسىنىڭ يېڭىلىنىشى ۋە تەكرارلىنىشى بىلەن ، مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇشنىڭ كلىنىكىلىق قوللىنىلىشى بارغانسىرى كېڭەيدى ۋە چوڭقۇرلاشتى ، مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇش بازىرى تېز تەرەققىيات دەۋرىگە قەدەم قويدى.

ئاپتور بازاردىكى كۆپ ئۇچرايدىغان مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇش تېخنىكىسىنى خۇلاسىلەپ ، ئۈچ قىسىمغا بۆلۈنگەن: بىرىنچى قىسمى PCR تېخنىكىسىنى ، ئىككىنچى قىسمى يادرو كىسلاتاسىنى ئىسسىقلىق بىلەن كۈچەيتىش تېخنىكىسىنى ، ئىككىنچى قىسمى تەرتىپلەش تېخنىكىسىنى تونۇشتۇرىدۇ.

01

بىرىنچى قىسىم: PCR تېخنىكىسى

PCR تېخنىكىسى

PCR (پولىمېرازا زەنجىرسىمان ئىنكاسى) ۋىرۇسلۇق DNA كۈچەيتىش تېخنىكىسىنىڭ بىرى بولۇپ ، تارىخى 30 نەچچە يىل.

PCR تېخنىكىسى 1983-يىلى ئامېرىكىنىڭ سېتۇس شەھىرىدىكى Kary Mullis تەرىپىدىن باشلامچى بولغان.مۇلىس 1985-يىلى PCR پاتېنتىغا ئىلتىماس سۇنغان ۋە شۇ يىلى ئىلىم-پەن توغرىسىدىكى تۇنجى PCR ئىلمىي ماقالىسىنى ئېلان قىلغان.مۇلىس 1993-يىلى نوبېل خىمىيىلىك مۇكاپاتىغا ئېرىشكەن.

PCR نىڭ ئاساسىي پرىنسىپلىرى

PCR نىشانلىق DNA پارچىلىرىنى بىر مىليون قېتىمدىن ئاشۇرالايدۇ.پرىنسىپ شۇكى ، DNA پولىمېراسىنىڭ كاتالىزاتورى ئاستىدا ، ئاتا-ئانىلار تاياقچىسى DNA قېلىپ سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ ، كونكرېت كۆرسەتكۈچ كېڭەيتىشنىڭ باشلىنىش نۇقتىسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.ئۇ دانىخورەك ، دانىخورەك ۋە كېڭەيتىش قاتارلىق باسقۇچلار ئارقىلىق ۋىرۇستا كۆپەيتىلگەن.قىزىنىڭ تاياقچە DNA جەريانى ئاتا-ئانىلارنىڭ قېلىپ قېلىپىنى تولۇقلايدۇ.

ئۆلچەملىك PCR جەريانى ئۈچ باسقۇچقا بۆلىنىدۇ:

1. ئايرىش: يۇقىرى تېمپېراتۇرا ئىشلىتىپ DNA قوش لىنىيىسىنى ئايرىڭ.يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا (93-98 سېلسىيە گرادۇس) DNA قوش سىزىق ئارىسىدىكى ھىدروگېن رىشتىسى بۇزۇلدى.

2. تۇتاشتۇرۇش: قوش سىزىقلىق DNA ئايرىلغاندىن كېيىن ، تېمپېراتۇرا تۆۋەنلەيدۇ ، بۇنداق بولغاندا دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ تاق لىنىيىلىك DNA بىلەن باغلىنالايدۇ.

3. كېڭەيتىش: DNA پولىمېراسى تېمپېراتۇرا تۆۋەنلىگەندە باغلانغان پىرىمېردىن DNA يولىنى بويلاپ تولۇقلاش يولىنى بىرىكتۈرۈشكە باشلايدۇ.كېڭەيتىش تاماملانغاندىن كېيىن ، دەۋرىيلىك تاماملىنىپ ، DNA پارچىلىرى بىر ھەسسە قاتلىنىدۇ.

بۇ ئۈچ باسقۇچنى 25-35 قېتىم تەكرارلىساق ، DNA پارچىلىرى سانى شىددەت بىلەن ئاشىدۇ.

PCR نىڭ ئەقىل-پاراسىتى شۇكى ، ئوخشىمىغان پرېرمېرلار ئوخشىمىغان نىشان گېنى ئۈچۈن لايىھەلەنگەن بولۇپ ، قىسقا ۋاقىت ئىچىدە نىشان گېن پارچىلىرىنى كۈچەيتكىلى بولىدۇ.

ھازىرغا قەدەر PCR نى ئادەتتىكى PCR ، فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR ۋە رەقەملىك PCR دىن ئىبارەت ئۈچ تۈرگە ئايرىشقا بولىدۇ.

بىرىنچى ئەۋلاد ئادەتتىكى PCR

ئادەتتىكى PCR كۈچەيتمە ئەسۋابىدىن پايدىلىنىپ نىشان گېننى كېڭەيتىڭ ، ئاندىن ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېزىدىن پايدىلىنىپ مەھسۇلاتنى بايقايسىز ، پەقەت سۈپەتلىك ئانالىز قىلغىلى بولىدۇ.

بىرىنچى ئەۋلاد PCR نىڭ ئاساسلىق كەمچىلىكى:

-كۆپرەك بولمىغان كېڭەيتىش ۋە يالغان ئاكتىپ نەتىجىلەرگە مايىل.

-بايقاشقا ئۇزۇن ۋاقىت كېتىدۇ ، مەشغۇلات ئاۋارىچىلىك.

-بىر سۈپەت سىنىقى ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.

ئىككىنچى ئەۋلاد فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR

فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR (Real-Time PCR) يەنە qPCR دەپمۇ ئاتىلىدۇ ، ئۇ رېئاكسىيە سىستېمىسىنىڭ ئىلگىرىلىشىنى كۆرسىتىپ بېرەلەيدىغان فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى قوشۇش ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتلارنىڭ يىغىلىشىنى نازارەت قىلىش ۋە فلۇئورېسسېنسىيە ئەگرى سىزىقى ئارقىلىق نەتىجىگە ھۆكۈم قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ ، ئۇنى Cq قىممىتى ۋە ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنىڭ ياردىمى بىلەن مىقدارلاشتۇرغىلى بولىدۇ.

QPCR تېخنىكىسى يېپىق سىستېمىدا ئېلىپ بېرىلغاچقا ، بۇلغىنىش ئېھتىماللىقى تۆۋەنلەيدۇ ، مىقدارنى تەكشۈرۈشتە فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى نازارەت قىلغىلى بولىدۇ ، شۇڭا ئۇ كلىنىكىلىق تەجرىبىدە ئەڭ كەڭ قوللىنىلىپ ، PCR دىكى يېتەكچى تېخنىكىغا ئايلاندى.

ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR دا ئىشلىتىلىدىغان فلۇئورېسسېنسىيەلىك ماددىلارنى: TaqMan فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى ، مولېكۇلا ماياك ۋە فلۇئورېسسېن بوياق دەپ ئايرىشقا بولىدۇ.

1) TaqMan فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى:

PCR كېڭەيتىش جەريانىدا ، بىر جۈپ پىرىسلاش قوشقاندا ئالاھىدە فلۇئورېسسېنسىيە تەكشۈرۈش ئەسۋابى قوشۇلىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئولىگونۇكلېئوتىد بولۇپ ، ئىككى ئۇچىغا ئايرىم-ئايرىم ھالدا مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى ۋە ئۆچۈرگۈچى فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى دەپ بەلگە قويۇلغان.

تەكشۈرۈش ئەسۋابى مۇكەممەل بولغاندا ، مۇخبىر گۇرۇپپىسى تارقاتقان فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسى تەرىپىدىن سۈمۈرۈلىدۇ.PCR كۈچەيتىلگەندە ، تاك فېرمېنتىنىڭ 5′-3 ′ تاشقى ھەرىكەت پائالىيىتى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى تازىلاپ ۋە تۆۋەنلىتىدۇ ، بۇ مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى ۋە ئۆچۈرگۈچى فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى ئايرىلىدۇ ، شۇڭا فلۇئورېسسېنسىيەنى نازارەت قىلىش سىستېمىسى فتور فېرمېنسىيىسى سىگنالىنى قوبۇل قىلالايدۇ ، يەنى ھەر قېتىم DNA توپى كۈچەيگەندە ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ توپلىنىشى پۈتۈنلەي ماس قەدەمدە ھاسىل بولىدۇ.

2) SYBR فلۇئورېسسېنسىيە بوياقلىرى:

PCR ئىنكاس سىستېمىسىدا SYBR فلۇئورېسسېنسىيە بوياقتىن ئېشىپ كەتكەن.SYBR فلۇئورېسسېنسىيە بوياق DNA قوش لىنىيىسىگە ئالاھىدە كىرگۈزۈلمىگەندىن كېيىن ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى تارقىتىدۇ.زەنجىرگە كىرگۈزۈلمىگەن SYBR بوياق مولېكۇلاسى ھېچقانداق فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى چىقارمايدۇ ، بۇ ئارقىلىق فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ كۆپىيىشى PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ كۆپىيىشى بىلەن پۈتۈنلەي ماس قەدەمدە بولىدۇ.SYBR پەقەت قوش لىنىيىلىك DNA بىلەن باغلىنىدۇ ، شۇڭا ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئارقىلىق PCR ئىنكاسىنىڭ كونكرېت ياكى ئەمەسلىكىنى ئېنىقلىغىلى بولىدۇ.

3) مولېكۇلالىق ماياك

ئۇ غول ئايلانما قوش ماركىلىق oligonucleotide تەكشۈرۈش ئەسۋابى بولۇپ ، 5 ۋە 3 ئۇچىدىكى تەخمىنەن 8 بازىنىڭ چاچ ياساش قۇرۇلمىسىنى شەكىللەندۈرىدۇ.ئىككى ئۇچىدىكى يادرو كىسلاتاسىنىڭ تەرتىپى بىر-بىرىنى تولۇقلاپ ، فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى ۋە ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسىنىڭ چىڭ بولۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.تاقىلىپ قالسا ، ئۇ فلۇئورېسسېنسىيە پەيدا قىلمايدۇ.

PCR مەھسۇلاتى بارلىققا كەلگەندىن كېيىن ، تۇتاشتۇرۇش جەريانىدا ، مولېكۇلا ماياكنىڭ ئوتتۇرا قىسمى مەلۇم بىر DNA تەرتىپى بىلەن ماسلاشتۇرۇلۇپ ، فلۇئورېسسېنسىيە گېنى ئۆچۈرگۈچى گېندىن ئايرىپ فلۇئورېسسېنسىيە ھاسىل قىلىدۇ.

ئىككىنچى ئەۋلاد PCR نىڭ ئاساسلىق كەمچىلىكى:

سەزگۈرلۈك يەنىلا كەمچىل ، تۆۋەن كۆپەيتىلگەن ئەۋرىشكىلەرنى بايقاش توغرا ئەمەس.

تەگلىك قىممىتى تەسىرى بار ، نەتىجىدە ئاسانلا ئارىلىشىش بولىدۇ.

ئۈچىنچى ئەۋلاد رەقەملىك PCR

رەقەملىك PCR (DigitalPCR ، dPCR ، Dig-PCR) ئاخىرقى نۇقتىنى تەكشۈرۈش ئارقىلىق نىشان تەرتىپىنىڭ كۆپەيتىلگەن نومۇرىنى ھېسابلايدۇ ، ھەمدە ئىچكى كونترول ۋە ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنى ئىشلەتمەي تۇرۇپ ، مۇتلەق مىقدارنى ئېنىقلىيالايدۇ.

رەقەملىك PCR ئاخىرقى نۇقتىنى بايقاشنى ئىشلىتىدۇ ھەمدە Ct قىممىتى (دەۋرىيلىك بوسۇغىسى) غا باغلىق ئەمەس ، شۇڭا رەقەملىك PCR ئىنكاسى كۈچەيتىش ئۈنۈمىنىڭ تەسىرىگە ئانچە ئۇچرىمايدۇ ، PCR رېئاكسىيە چەكلىمىسىگە بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارى يۇقىرى كۆتۈرۈلۈپ ، توغرىلىقى ۋە كۆپىيىشچانلىقى يۇقىرى بولىدۇ.

يۇقىرى سەزگۈرلۈك ۋە يۇقىرى ئېنىقلىق ئالاھىدىلىكى سەۋەبىدىن ، ئۇ PCR رېئاكسىيە چەكلىگۈچىنىڭ ئاسانلا ئارىلىشىشىغا ئۇچرىمايدۇ ، ئۇ ئۆلچەملىك مەھسۇلات بولمىسا ھەقىقىي مۇتلەق مىقدارنى ئەمەلگە ئاشۇرالايدۇ ، بۇ تەتقىقات ۋە قوللىنىشچان قىزىق نۇقتىغا ئايلاندى.

ئوخشىمىغان ئىنكاس قايتۇرۇش شەكلىگە ئاساسەن ، ئۇنى مىكرو تىپتىكى سۇيۇقلۇق ، ئۆزەك ۋە تامچە سىستېمىسىدىن ئىبارەت ئۈچ خىلغا بۆلۈشكە بولىدۇ.