تۇرۇبا ئۇچى ۋە EP تۇرۇبىسىنى ستېرېزلاش قاتارلىقلار.
1. دىئونسىزلانغان سۇ بىلەن% 0.1 (مىڭدىن يۇقىرى) DEPC (يۇقىرى زەھەرلىك ماددا) تەييارلاپ ، ئۇنى ئىس-تۈتەك قېپىدا ئېھتىيات بىلەن ئىشلىتىڭ ھەمدە يورۇقلۇقتىن 4 سېلسىيە گرادۇسقىچە ساقلاڭ.
DEPC سۈيى DEPC بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان ساپ سۇ بولۇپ ، يۇقىرى تېمپېراتۇرا ۋە يۇقىرى بېسىم بىلەن مىكروبسىزلىنىدۇ.RNase ، DNase ۋە ئاقسىلدىن خالىي ئىكەنلىكى سىناق قىلىندى.
2. تۇرۇبا ئۇچى ۋە EP تۇرۇبىسىنى% 0.1 DEPC غا سېلىڭ ، تۇرۇبا ئۇچى ۋە EP تۇرۇبىسىنىڭ% 0.1 DEP بىلەن تولدۇرۇلۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.
3. نۇردىن ساقلاڭ ، بىر كېچە تۇرايلى (12-24h)
4. ئۇچى ۋە EP تۇرۇبىسى بار قۇتىنى DEPC غا چىلاشنىڭ ھاجىتى يوق.ئۇچى ياكى EP تۇرۇبىسىدىكى DEPC سۈيىنى تەخمىنەن ئېلىۋەتكەندىن كېيىن ، ئۇنى ئوراپ ئوراپ بېرىڭ.
5. 121 سېلسىيە گرادۇس ، 30 مىنۇت
6. 180 سېلسىيە گرادۇس ، بىر نەچچە سائەت قۇرۇلىدۇ (كەم دېگەندە 3 سائەت)
ئەسكەرتىش: a.DEPC نى بىر تەرەپ قىلغاندا latex پەلەي ۋە ماسكا كىيىڭ!b ، ياكى DEPC مىكروبسىزلاندۇرۇلماي ، 130 ℃ ، 90 مىنۇتلۇق ئاپتوماتىك ئوكۇل (نۇرغۇن تەجرىبىخانىلار ئىككى قېتىم يۇقىرى تېمپېراتۇرىنى مىكروبسىزلاندۇرۇش)
RNA ئېلىشنى ئويلىشىش
توقۇلما RNA ئايرىلىش مەغلۇبىيىتىدىن ئىبارەت ئىككى چوڭ ھادىسە
RNA نىڭ بۇزۇلۇشى ۋە توقۇلمىلاردىكى بۇلغانمىلارنىڭ قالدۇقلىرى ،بۇزۇلۇشقا كەلسەك ، ئالدى بىلەن مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەردىن ئېلىنغان RNA نىڭ نېمىشقا ئاسان بۇزۇلمايدىغانلىقىنى كۆرۈپ باقايلى.ھازىر بار بولغان RNA ئېلىش رېئاكتورىنىڭ ھەممىسىدە RNase نى تىزگىنلەيدىغان تەركىبلەر بار.مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەرگە لىماتنى قوشۇڭ ، ئۇنى ئاددىيلا ئارىلاشتۇرۇڭ ، بارلىق ھۈجەيرىلەرنى لىمات بىلەن تولۇق ئارىلاشتۇرغىلى بولىدۇ ، ھۈجەيرىلەر پۈتۈنلەي لايلانغان بولىدۇ.ھۈجەيرىلەر لايلانغاندىن كېيىن ، لىزاتتىكى ئاكتىپ تەركىبلەر ھۈجەيرە ئىچىدىكى RNase نى دەرھال تورمۇزلايدۇ ، شۇڭا RNA ساقلىنىپ قالىدۇ.شۇنداق دېيىشكە بولىدۇكى ، مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەر لىزات بىلەن ئاسان ۋە تولۇق ئالاقىلاشقانلىقتىن ، ئۇلارنىڭ RNA ئاسان بۇزۇلمايدۇ.يەنە بىر جەھەتتىن ، توقۇلمىلاردىكى RNA ئاسانلا بۇزۇلۇپ كېتىدۇ ، چۈنكى توقۇلمىلاردىكى ھۈجەيرىلەر لىزات بىلەن تېز ئالاقىلىشىش ئاسان ئەمەس.يېتەرلىك ئالاقىلىشىش سەۋەبىدىن.شۇڭا ،RNA پائالىيىتىنى چەكلەش بىلەن بىرگە توقۇلمىلارنى بىر ھۈجەيرىگە ئايلاندۇرۇشنىڭ ئۇسۇلى بار دەپ پەرەز قىلساق ، چېكىنىش مەسىلىسى پۈتۈنلەي ھەل بولىدۇ.
سۇيۇق ئازوت زاۋۇتى بۇنداق ئۈنۈملۈك ئۇسۇل.قانداقلا بولمىسۇن ، سۇيۇق ئازوت پىشۇرۇش ئۇسۇلى بەك ئاۋارىچىلىك ، بولۇپمۇ ئەۋرىشكە سانى كۆپ بولغاندا.بۇ كېيىنكى ئەڭ ياخشى نەرسىنى بارلىققا كەلتۈردى: ھەمجىنىسلاشتۇرغۇچى.Thehomogenizerبۇ ئۇسۇل ھۈجەيرىلەر لىزات بىلەن ئۇچرىشىشتىن بۇرۇن RNase پائالىيىتىنىڭ قانداق چەكلىنىدىغانلىقى توغرىسىدىكى سوئالنى ئويلاشمايدۇ ، بەلكى توقۇلمىلارنىڭ قالايمىقانلىشىش نىسبىتىنىڭ ھۈجەيرە ئىچىدىكى RNase نىڭ RN نى تۆۋەنلىتىش سۈرئىتىدىن تېز بولۇشىنى تىلەيدۇ.
ئېلېكترلىك بىرىكمە ماددىنىڭ ئۈنۈمى تېخىمۇ ياخشى ،ھەمدە ئەينەك بىرىكتۈرگۈچىنىڭ ئۈنۈمى ناچار ، ئەمما ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، ئوخشاش بىرىكتۈرۈش ئۇسۇلى چېكىنىش ھادىسىسىنىڭ ئالدىنى ئالالمايدۇ.شۇڭلاشقا ، ئەگەر چىقىرىۋېتىش تۆۋەنلەپ كەتسە ، ئەسلىدىكى ئېلېكتر بىرىكمىسى سۇيۇق ئازوت بىلەن ئۇۋىلاشقا ئىشلىتىلىشى كېرەك.ئەسلى ئەينەك گوموگېنېرلاشتۇرغۇچنى ئېلېكتر بىرىكمىسىگە ئۆزگەرتىش ياكى سۇيۇق ئازوت بىلەن بىۋاسىتە ئورۇش كېرەك.مەسىلە 100% كە يېقىن مۇمكىن.ھەل قىلىڭ.
كېيىنكى تەجرىبىلەرگە تەسىر قىلغان نىجاسەت قالدۇق مەسىلىسىنىڭ بۇزۇلۇشىغا قارىغاندا كۆپ خىل سەۋەبلىرى بار ، ھەل قىلىش چارىسىمۇ ئوخشىمايدۇ.خۇلاسە قىلغاندا ،ئەگەر توقۇلمىلاردا چېكىنىش ياكى قالدۇق ماددىلار بولسا ، چوقۇم كونكرېت تەجرىبە ماتېرىياللىرىنى ئېلىش ئۇسۇلى / رېئاكتىپنى ئەلالاشتۇرۇش كېرەك.ئەلالاشتۇرۇش ئۈچۈن قىممەتلىك ئەۋرىشكىڭىزنى ئىشلىتىشىڭىزنىڭ ھاجىتى يوق: سىز بازاردىن بېلىق / توخۇغا ئوخشاش بىر قىسىم كىچىك ھايۋانلارنى سېتىۋالالايسىز ، RNA ئېلىش ئۈچۈن ماتېرىيالنىڭ مۇناسىپ قىسمىنى ئالسىڭىز ، يەنە بىر قىسمى ئاقسىل ئېلىش - ئېغىز ، ئاشقازان ۋە ئۈچەي بىلەن ئېزىش.
ئېلىنغان RNA نىڭ نىشان RNA ئوخشىمىغان ئىز قوغلاپ سىناق قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ ، ئۇنىڭ سۈپەت تەلىپى ئوخشىمايدۇ
cDNA كۇتۇپخانا قۇرۇلۇشى فېرمېنت رېئاكسىيە چەكلىگۈچىنىڭ قالدۇقلىرى بولمىغان RNA پۈتۈنلۈكىنى تەلەپ قىلىدۇ.شىمال تېخىمۇ يۇقىرى RNA پۈتۈنلۈكىنى ۋە فېرمېنت رېئاكسىيەنى چەكلەش قالدۇقلىرىغا بولغان تۆۋەن تەلەپنى تەلەپ قىلىدۇ.RT-PCR بەك يۇقىرى RNA پۈتۈنلۈكىنى تەلەپ قىلمايدۇ ،ئەمما ئېنزىمنىڭ ئىنكاسىنى چەكلەيدۇ.قالدۇق تەلەپ قاتتىق.كىرگۈزۈش چىقىرىشنى بەلگىلەيدۇ.ھەر قېتىم نىشان ئەڭ يۇقىرى ساپلىق RNA غا ئېرىشىش ئۈچۈن ، كىشىلەرگە ۋە پۇلغا كېتىدۇ.
ئەۋرىشكە توپلاش / ساقلاش
ناچارلىشىشقا تەسىر كۆرسىتىدىغان ئامىللار ئەۋرىشكە تىرىك بەدەندىن ياكى ئەسلىدىكى ئۆسۈپ يېتىلىش مۇھىتىدىن ئايرىلغاندىن كېيىن ، ئەۋرىشكە ئىچىدىكى ئىچكى ئېنزىملار RNA نى تۆۋەنلىتىشكە باشلايدۇ ،ھەمدە چېكىنىش نىسبىتى ئىچكى فېرمېنت ۋە تېمپېراتۇرا بىلەن مۇناسىۋەتلىك.ئەنئەنە بويىچە ، ئىچكى مەنبەلىك ئېنزىم پائالىيىتىنى پۈتۈنلەي چەكلەشنىڭ پەقەت ئىككى خىل ئۇسۇلى بار: لىزاتنى دەرھال قوشۇپ ، ئەتراپلىق ۋە تېز بىرىكتۈرۈشكىچىك پارچىلارغا بۆلۈپ ، سۇيۇق ئازوتتا دەرھال توڭلىتىڭ.ھەر ئىككى خىل ئۇسۇل تېز مەشغۇلات قىلىشنى تەلەپ قىلىدۇ.كېيىنكىسى بارلىق ئەۋرىشكەلەرگە ماس كېلىدۇ ، ئالدىنقىسى پەقەت ھۈجەيرىلەر ۋە ئىچكى مەنبەلىك ئېنزىمنىڭ مىقدارى تۆۋەن بولغان توقۇلمىلارغا ماس كېلىدۇ.كونكېرت قىلىپ ئېيتقاندا ، ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرى ، جىگەر ، تىمۇس ، ئاشقازان ئاستى بېزى ، تال ، مېڭە ، ماي ، مۇسكۇل توقۇلمىلىرى قاتارلىقلار مېڭىشتىن ئىلگىرى ئەڭ ياخشىسى سۇيۇق ئازوت بىلەن توڭلىتىلىدۇ.
ئەۋرىشكىلەرنىڭ پارچىلىنىشى ۋە بىرلىشىشى
چېكىنىش ۋە ئۈنۈمگە تەسىر كۆرسىتىدىغان ئامىللار ئەۋرىشكە پارچىلىنىشئەتراپلىق بىرىكتۈرۈش ئۈچۈنبۇ RNA نىڭ تولۇق ۋە تولۇق تارقىتىلىشى ئۈچۈندۇر.ھۈجەيرىلەر بۇزۇلماي بىۋاسىتە بىرىكتۈرۈلسە بولىدۇ.توقۇلمىلار بۇزۇلغاندىن كېيىن ئاندىن بىرلىككە كېلىدۇ.ئېچىتقۇ ۋە باكتېرىيەنى بىرلىككە كەلتۈرۈشتىن بۇرۇن مۇناسىپ ئېنزىم بىلەن پارچىلاش كېرەك.ئىچكى ئاجراتما فېرمېنتى تۆۋەن بولغان توقۇلمىلار ۋە ئوخشاش جىسىملارنىڭ بىرىكىشى ئاسان بولغان توقۇلمىلارنى لىزاتتا بىرلا ۋاقىتتا ئېزىپ ، ئوخشاشلاشتۇرغىلى بولىدۇ.ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرى ، جىگەر ، تىمۇس ، ئاشقازان ئاستى بېزى ، تال ، مېڭە ، ماي ، مۇسكۇل توقۇلمىلىرى ۋە باشقا ئەۋرىشكەلەر ، ئۇلارنىڭ ئىچكى مەنبەلىك ئېنزىم مىقدارى يۇقىرى ياكى ئاسان بىرىكتۈرۈلمەيدۇ ،شۇڭا توقۇلمىلارنىڭ قالايمىقانلىشىشى ۋە بىرىكتۈرۈلۈشى ئايرىم ئېلىپ بېرىلىشى كېرەك.پارچىلىنىشنىڭ ئەڭ ئىشەنچلىك ۋە ئەڭ ئۈنۈملۈك ئۇسۇلى سۇيۇق ئازوت بىلەن ئورۇش ، ئەڭ ئىشەنچلىك بىرىكتۈرۈش ئۇسۇلى بولسا ئېلېكتر گوموگېنلاشتۇرغۇچ ئىشلىتىش.سۇيۇق ئازوت بىلەن ئورۇش ھەققىدىكى ئالاھىدە ئەسكەرتىش: ئەۋرىشكەنى پۈتۈن ئورۇش جەريانىدا ئېرىتمەسلىك كېرەك ، چۈنكى توڭلىغاندا ئېنگېن فېرمېنتى تېخىمۇ كۆپ ئىشلەيدۇ.
Lysate نى تاللاش
مەشغۇلاتنىڭ قۇلايلىقلىقى ۋە قالدۇق ئىچكى مەنبەلىك بۇلغانمىلارنىڭ ئامىلىغا تەسىر كۆرسىتىش ئادەتتە كۆپ ئىشلىتىلىدىغان لىز ئېرىتمىسى RNase نىڭ پائالىيىتىنى چەكلىيەلەيدۇ.شۇڭلاشقا ، لىز ھەل قىلىش چارىسىنى تاللاشنىڭ مۇھىم نۇقتىسى تازىلاش ئۇسۇلى بىلەن بىرلەشتۈرۈشنى ئويلىشىش.بۇنىڭ سىرتىدا:ئىچكى ئاجراتما فېرمېنتى يۇقىرى ئەۋرىشكەلەردە فېنول بار لىزات ئىشلىتىش ئارقىلىق ئىچكى فېرمېنتنىڭ ئاكتىپلاش ئىقتىدارىنى ئاشۇرۇش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
ساپلاشتۇرۇش ئۇسۇلىنى تاللاش
قالدۇق ئىچكى ئاجراتمىلارغا تەسىر كۆرسىتىدىغان ئامىللار ، ئېلىش سۈرئىتى ھۈجەيرە قاتارلىق پاكىز ئەۋرىشكە ئۈچۈن ، قولىڭىزدىكى ھەر قانداق تازىلاش ئۇسۇلى بىلەن قانائەتلىنەرلىك نەتىجىگە ئېرىشكىلى بولىدۇ.ئەمما باشقا نۇرغۇن ئەۋرىشكەلەرگە ، بولۇپمۇ ئۆسۈملۈك ، جىگەر ، باكتېرىيە قاتارلىق يۇقىرى دەرىجىدىكى بۇلغانمىلارغا ماس كېلىدىغان تازىلاش ئۇسۇلىنى تاللاش تولىمۇ مۇھىم.تۈۋرۈك مەركەزدىن قاچۇرۇش تازىلاش ئۇسۇلىنىڭ ئېلىش سۈرئىتى تېز بولۇپ ، RNA نىڭ كېيىنكى فېرمېنتلىق ئىنكاسىغا تەسىر كۆرسىتىدىغان بۇلغانمىلارنى ئۈنۈملۈك چىقىرىپ تاشلىيالايدۇ ، ئەمما ئۇ قىممەت (Foregene تەننەرخى يۇقىرى يۈرۈشلۈك زاپچاسلار بىلەن تەمىنلەيدۇ ، تېخىمۇ كۆپ تەپسىلاتلارنى چېكىڭبۇ يەردە);LiCl ھۆل-يېغىنغا ئوخشاش تېجەشلىك ۋە كلاسسىك تازىلاش ئۇسۇلىنى قوللانسىڭىزمۇ قانائەتلىنەرلىك نەتىجىگە ئېرىشكىلى بولىدۇ ، ئەمما مەشغۇلات ۋاقتى ئۇزۇن..
RNA ئېلىش ئۈچۈن «ئۈچ ئىنتىزام ۋە سەككىز دىققەت»
ئىنتىزام 1:تاشقى فېرمېنتلارنىڭ بۇلغىنىشىنى تۈگىتىڭ.
ئەسكەرتىش 1:ماسكا ۋە پەلەي كىيىڭ.
ئەسكەرتىش 2:سىناققا قاتناشقان مەركەزدىن ياسالغان نەيچە ، كۆرسەتمە بېشى ، تۇرۇبا تاياقچىسى ، ئېلېكترو فورېز باكى ۋە تەجرىبە ئورۇندۇقلىرىنى بىر تەرەپ قىلىش كېرەك.
ئەسكەرتىش 3:سىناققا قاتناشقان رېئاكتور / ھەل قىلىش چارىسى ، بولۇپمۇ سۇ چوقۇم RNase يوق بولۇشى كېرەك.
2-ئىنتىزام:ئىچكى فېرمېنتلارنىڭ پائالىيىتىنى توسىدۇ
ئەسكەرتىش 4:مۇۋاپىق بولغان بىرلەشتۈرۈش ئۇسۇلىنى تاللاڭ.
ئەسكەرتىش 5:ماس كېلىدىغان لاينى تاللاڭ.
ئەسكەرتىش 6:ئەۋرىشكىنىڭ باشلىنىش مىقدارىنى كونترول قىلىڭ.
3-ئىنتىزام:ئېلىش مەقسىتىڭىزنى ئايدىڭلاشتۇرۇڭ
ئەسكەرتىش 7:ھەر قانداق لەيلىمە سىستېما ئەۋرىشكە ئېلىشنىڭ ئەڭ يۇقىرى چېكىگە يېقىنلاشقاندا ، ئېلىش مۇۋەپپەقىيەت نىسبىتى تېز تۆۋەنلەيدۇ.
ئەسكەرتىش 8:RNA ئېلىشنىڭ مۇۋەپپەقىيەتلىك بولۇشىدىكى بىردىنبىر ئىقتىسادىي ئۆلچەم كېيىنكى سىناقلاردا مۇۋەپپەقىيەت قازىنىش ، مۇۋەپپەقىيەت قازىنىش ئەمەس.
RNase بۇلغىنىشنىڭ ئالدىنقى 10 مەنبەسى
1. بارماق تاشقى ئېنزىمنىڭ بىرىنچى مەنبەسى ، شۇڭا پەلەينى دائىم كىيىش ۋە ئالماشتۇرۇش كېرەك.ئۇنىڭدىن باشقا ، ماسكا چوقۇم كىيىش كېرەك ، چۈنكى نەپەسلىنىشمۇ ئېنزىمنىڭ مۇھىم مەنبەسى.پەلەي ماسكا تاقاشنىڭ قوشۇمچە پايدىسى تەجرىبە قىلغۇچىنى قوغداش.
2. تۇرۇبا ئۇچى ، مەركەزدىن قاچۇرۇش تۇرۇبىسى ، تۇرۇبا يولى - RNase نى يالغۇز مىكروبسىزلاندۇرۇش ئارقىلىق قوزغىتىشقا بولمايدۇ ، شۇڭا تۇرۇبا ئۇچى ۋە مەركەزدىن قاچۇرۇش تۇرۇبىسى DEPC دا بىر تەرەپ قىلىنغان دەپ بەلگە قويۇلغان تەقدىردىمۇ ، DEPC بىلەن بىر تەرەپ قىلىنىشى كېرەك.ئەڭ ياخشىسى ئالاھىدە مەقسەتلىك تۇرۇبا ئىشلىتىش ، ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئۇنى% 75 ئىسپىرتلىق پاختا بىلەن سۈرتۈڭ ، بولۇپمۇ كالتەك.ئۇنىڭدىن باشقا ، باش تازىلاش ئۈسكۈنىسىنى ئىشلەتمەسلىككە كاپالەتلىك قىلىڭ.
3. سۇ / بۇففېر چوقۇم RNase نىڭ بۇلغىنىشىدىن خالىي بولۇشى كېرەك.
4. ھېچ بولمىغاندا سىناق جەدۋىلىنى% 75 ئىسپىرتلىق پاختا شار بىلەن پاكىز سۈرتۈش كېرەك.
5. ئىچكى مەنبەلىك RNase بارلىق توقۇلمىلاردا ئىچكى ئېنزىم بار ، شۇڭا سۇيۇق ئازوت بىلەن توقۇلمىلارنى تېز مۇزلاش بۇزۇلۇشنى ئازايتىشنىڭ ئەڭ ياخشى ئۇسۇلى.سۇيۇق ئازوت ساقلاش / ئۇۋىلاش ئۇسۇلى ھەقىقەتەن قولايسىز ، ئەمما ئۇ يۇقىرى دەرىجىدىكى ئېنزىم فېرمېنتى بار توقۇلمىلارنىڭ بىردىنبىر يولى.
6. RNA ئەۋرىشكىسى RNA ئېلىش مەھسۇلاتلىرىدا RNase نىڭ بۇلغىنىش ئىزلىرى بولۇشى مۇمكىن.
7. پلازما ئېرىتمىسى پلازما ئېرىتمىسى Rnase نى ئىشلىتىپ RNA نى تۆۋەنلىتىدۇ ، قالدۇق Rnase ئاقسىل K بىلەن ھەزىم قىلىنىشى ۋە PCI تەرىپىدىن چىقىرىلىشى كېرەك.
8. RNA ساقلاش گەرچە تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ساقلانغان تەقدىردىمۇ ، RNase نىڭ مىقدارى RNA نىڭ چېكىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.RNA نى ئۇزۇن مۇددەت ساقلاپ قېلىشنىڭ ئەڭ ياخشى چارىسى تۇز / ئىسپىرتتىن توختىتىش ، چۈنكى ئىسپىرت تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا بارلىق ئېنزىم پائالىيىتىنى چەكلەيدۇ.
9. كاتەكچە (Ca, Mg) بۇ ئىئونلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغاندا ، 80C دە 5 مىنۇت قىزىتقاندا RNA نىڭ يېرىلىپ كېتىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، شۇڭا RNA نى قىزىتىشقا توغرا كەلسە ، قوغداش ئېرىتمىسىدە خىلىتلاش دورىسى بولۇشى كېرەك (1mM ناترىي سىترات ، pH 6.4).
10. كېيىنكى سىناقلاردا ئىشلىتىلگەن ئېنزىملار RNase تەرىپىدىن بۇلغانغان بولۇشى مۇمكىن.
RNA ئېلىشنىڭ 10 ئۇسۇلى
1: RNase پائالىيىتىنىڭ تېز ئالدىنى ئېلىش.ئەۋرىشكەلەر يىغىۋېلىنغاندىن كېيىن تېز مۇزلاپ كېتىدۇ ، لىز جەريانىدا تېز مەشغۇلات قىلىش ئارقىلىق RNase ئاكتىپسىزلىنىدۇ.
2: رىبوزىم مىقدارى يۇقىرى توقۇلمىلارغا ماس كېلىدىغان ئېلىش ئۇسۇلىنى تاللاڭ ، ياغ توقۇلمىلىرى ئەڭ ياخشىسى فېنول بولغان ئۇسۇلنى ئىشلىتىش.
3: ئالدىن پەرەز قىلىش سۈپىتى شىمال ، cDNA كۇتۇپخانا قۇرۇلۇشى يۇقىرى سەمىمىيەتنى تەلەپ قىلىدۇ ، RT-PCR ۋە RPA (Ribonuclease قوغداش ئەسۋابى) يۇقىرى سەمىمىيەت تەلەپ قىلمايدۇ.RT-PCR يۇقىرى ساپلىقنى تەلەپ قىلىدۇ (ئېنزىم چەكلەش قالدۇقى).
4: تولۇق بىر گەۋدىلىشىش مەھسۇلاتنى ياخشىلاش ۋە تۆۋەنلەشنى ئازايتىشنىڭ ئاچقۇچى.
5: RNA ئېلېكتروفورېز بايقاشنىڭ مۇكەممەللىكىنى تەكشۈرۈڭ ، 28S: 18S = 2: 1 تولۇق بەلگە ، 1: 1 مۇ كۆپىنچە سىناقلاردا قوبۇل قىلىنىدۇ.
6: RT-PCR ئۈچۈن DNA نى ئېلىۋېتىش ، گۇرۇپپا ئانالىزى ئەڭ ياخشىسى Dnase I نى ئىشلىتىپ DNA نى چىقىرىۋېتىش كېرەك.
7: تاشقى فېرمېنتنىڭ بۇلغىنىشىنى ئازايتىڭ - ئېنزىمنى سىرتتىن ئىمپورت قىلىشقا بولمايدۇ.
8: تۆۋەن قويۇقلۇقتىكى يادرو كىسلاتاسىنى قويۇقلاشتۇرغاندا ، يامغۇر يېغىش رېئاكتورى قوشۇش كېرەك.ئەمما تەركىبىدە فېرمېنت ۋە DNA نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن.
9: زۆرۈر تېپىلغاندا RNA نى تولۇق ئېرىتىڭ ، 65C دە 5 مىنۇت قىزىتىڭ.
ماس كېلىدىغان ساقلاش ئۇسۇلى
ئۇنى قىسقا ۋاقىت ئىچىدە - 20C ، ئۇزۇن ۋاقىت - 80C غىچە ساقلىغىلى بولىدۇ.RNA ھوسۇلىنى ياخشىلاشنىڭ بىرىنچى قەدىمى ، ئوخشىمىغان ئەۋرىشكىلەرنىڭ RNA مەزمۇنىنىڭ زور دەرىجىدە پەرقلىنىدىغانلىقىنى ھېس قىلىش.جىگەر ، ئاشقازان ئاستى بېزى ، يۈرەك ، ئوتتۇراھال موللىق (0.05-2ug / mg) ، مەسىلەن ، چوڭ مېڭە ، تۆرەلمە ، بۆرەك ، ئۆپكە ، تىمساھ ، تۇخۇمدان ، بالىياتقۇ ، سۆڭەك ، ماي قاتارلىق كۆپ مىقداردا (<0.05ug / mg).
1: Lyse ھۈجەيرىسى RN نى قويۇپ بېرىدۇ - ئەگەر RNA قويۇپ بېرىلمىسە ، مەھسۇلات مىقدارى تۆۋەنلەيدۇ.ئېلېكترنى بىر گەۋدىلەشتۈرۈش باشقا بىرىكتۈرۈش ئۇسۇللىرىغا قارىغاندا ياخشى ئىشلەيدۇ ، ئەمما باشقا ئۇسۇللار بىلەن بىرلەشتۈرۈشكە ئېھتىياجلىق بولۇشى مۇمكىن ، مەسىلەن سۇيۇق ئازوتنى يېپىش ، فېرمېنتلىق ھەزىم قىلىش (Lysozyme / Lyticase).
2: ئېلىش ئۇسۇلىنى ئەلالاشتۇرۇش.فېنولنى ئاساس قىلغان ئۇسۇللاردىكى ئەڭ چوڭ مەسىلە تولۇق قاتلامغا ئايرىلماسلىق ۋە قىسمەن RNA يوقىتىش (خاسىيەتلىك ئادەمنى پۈتۈنلەي ئېلىۋەتكىلى بولمايدۇ).قاتلامنىڭ تولۇق بولماسلىقى يادرو كىسلاتاسى ۋە ئاقسىلنىڭ مىقدارىنىڭ يۇقىرى بولۇشىدىن كېلىپ چىققان بولۇپ ، ئىشلىتىلگەن لىزات مىقدارىنى كۆپەيتىش ياكى ئەۋرىشكە مىقدارىنى ئازايتىش ئارقىلىق ھەل قىلغىلى بولىدۇ.يېلىن توقۇلمىلىرىغا خلوروفورم ئېلىشنىڭ بىر قەدىمى قوشۇلدى.ئارقا پومپىدىن ياكى مەركەزدىن قاچقان ئورگانىك قەۋەتنى چىقىرىپ تاشلاش ئارقىلىق RNA زىيىنىنى ئازايتقىلى بولىدۇ.ستون مەركەزدىن قاچۇرۇشنى ئاساس قىلغان ئۇسۇللاردىكى ئەڭ چوڭ مەسىلە ئارتۇقچە ئەۋرىشكە.
كلاسسىك ئېلىش ئۇسۇللىرى
1. فېنولنى ساپلاشتۇرۇش: تەڭ مىقداردا 1: 1 فېنول / خلوروفورم قوشۇپ ، 1-2 مىنۇت كۈچەپ ئارىلاشتۇرۇڭ.Centrifuge يۇقىرى سۈرئەتتە 2 مىنۇت.خاسىيەتلىك ئادەمنى ئېھتىيات بىلەن ئېلىڭ (% 80-90%).ھەرگىزمۇ ئوتتۇرا قەۋەتكە چىقماڭ.ئوخشاش مىقداردىكى رېئاكسىيە ئېرىتمىسىنى فېنول / خلوروفورمغا قوشقىلى ۋە خاسىيەتلىك ماددىنى ئېلىۋەتكىلى بولىدۇ.بۇ ئىككى خاسىيەتلىك ماددىنى ئارىلاشتۇرۇپ يادرو كىسلاتاسىنىڭ ھۆل-يېغىن مىقدارىنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ.ئارىلاشتۇرغاندا بەك مۇلايىم بولماڭ ، بارلىق خاسىيەتلىك ماددىلارنى ئېلىۋېتىشكە ئۇرۇنماڭ.
2.% 70-% 80 لىك ئېتانول بىلەن يۇيۇش: يۇيۇش جەريانىدا ، يادرو كىسلاتاسىنى چوقۇم توختىتىپ ، قالدۇق تۇزنىڭ يۇيۇلىشىغا كاپالەتلىك قىلىش كېرەك.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، ئېتانولنى تۆكۈپ بولغاندىن كېيىن ، تېز سۈرئەتتە مەركەزدىن قاچۇرۇپ بىر نەچچە سېكۇنت تۇرغۇزۇڭ ، ئاندىن قالدۇق ئېتانولنى تۇرۇبا بىلەن ئېلىۋېتىڭ.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 5-10 مىنۇت تۇرغاندىن كېيىن ئېرىتىڭ.
11. ئالاھىدە تەشكىلاتلارنى ئېلىش
1. تالا توقۇلمىلىرى: يۈرەك / سۆڭەك مۇسكۇلى قاتارلىق تالا توقۇلمىلىرىدىن RNA ئېلىشنىڭ ئاچقۇچى توقۇلمىلارنى پۈتۈنلەي قالايمىقانلاشتۇرۇش.بۇ توقۇلمىلارنىڭ ھۈجەيرە زىچلىقى تۆۋەن ، شۇڭا توقۇلمىلارنىڭ ھەر بىر ئېغىرلىقى RNA نىڭ مىقدارى تۆۋەن ، ئىمكانقەدەر باشلىنىش مىقدارىنى ئىشلىتىش ئەڭ ياخشى.توڭلىتىش شارائىتىدا توقۇلمىلارنى ئوبدان ئېزىشقا كاپالەتلىك قىلىڭ.
2. ئاقسىل / ماي تەركىبى يۇقىرى توقۇلمىلار: مېڭە / ئۆسۈملۈك ماي تەركىبى يۇقىرى.PCI چىقىرىۋېتىلگەندىن كېيىن ، خاسىيەتلىك ماددىدا ئاق فوكۇس بار.خاسىيەتلىك ماددا چوقۇم خلوروفورم بىلەن قايتا چىقىرىلىشى كېرەك.
3. يۇقىرى يادرو كىسلاتاسى / رىبوزىم تەركىبىدىكى توقۇلمىلار: تال / تايمۇسنىڭ تەركىبىدە يۇقىرى يادرو كىسلاتاسى ۋە رىبوزىم بار.توڭلىتىش شارائىتىدا توقۇلمىلارنى ئۇۋىلاش تېز سۈرئەتتە بىرىكتۈرۈش رىبوزىمنى ئۈنۈملۈك قوزغىتالايدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، لىمات بەك يېپىشقاق بولسا (يادرو كىسلاتاسىنىڭ مىقدارى يۇقىرى بولغاچقا) ، PCI ئېلىش ئۈنۈملۈك قاتلامغا ئايرىلالمايدۇ.تېخىمۇ كۆپ لەيلىمە قوشۇش بۇ مەسىلىنى ھەل قىلالايدۇ.كۆپ خىل PCI ئېلىش تېخىمۇ كۆپ قالدۇق DNA نى چىقىرىۋېتەلەيدۇ.ئەگەر ئىسپىرت قوشۇلغاندىن كېيىنلا ئاق چۆكمە شەكىللەنسە ، ئۇ DNA نىڭ بۇلغىنىشىنى كۆرسىتىدۇ.ئېرىتىلگەندىن كېيىن كىسلاتالىق PCI بىلەن قايتا ئېلىش DNA نىڭ بۇلغىنىشىنى يوقىتالايدۇ.
4. ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرى: ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرى ھايۋان توقۇلمىلىرىغا قارىغاندا مۇرەككەپ.ئادەتتە ، ئۆسۈملۈكلەر سۇيۇق ئازوت شارائىتىدا بولىدۇ ، شۇڭا ئىچكى فېرمېنتلارنىڭ RNA نىڭ بۇزۇلۇشى ئاز ئۇچرايدۇ.ئەگەر چېكىنىش مەسىلىسى ھەل قىلىنمىسا ، چوقۇم ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى بۇلغانمىلار كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.نۇرغۇن ئۆسۈملۈكلەردىكى بۇلغانمىلار قالدۇق ماددىلارنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، قالدۇق ماددىلارنىڭ سەۋەبى ھەمىشە بۇ بۇلغانمىلارنىڭ RNA بىلەن بەزى ئوخشاشلىقلىرى بار: سىز چۆكتۈرۈۋالىسىز ، مەن چۆكتۈرۈۋالىمەن ، سىز ئېلان ۋە مەن ئېلان سۈرىتى.بۇ ئالاھىدىلىكلەر ئۇلارنىڭ ئىنتايىن كۈچلۈك ئېنزىمنى كونترول قىلغۇچى ئىكەنلىكىنى بەلگىلەيدۇ.
ھازىر سودا خاراكتېرلىك RNA ئېلىش رېئاكتورى كىچىك تەڭشەش ئارقىلىق بارلىق ھايۋان توقۇلمىلىرىغا دېگۈدەك ماسلىشالايدۇ ، ئەمما كۆپىنچە ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرىغا ماس كېلىدىغان سودا RNA ئېلىش رېئاكتورى ئاز.تەلىيىمىزگە ، Foregene ئالاھىدە تەمىنلىيەلەيدۇئۆسۈملۈك RNA ئېلىش زاپچاسلىرى, have haveئۆسۈملۈك ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى, ئۆسۈملۈك ئومۇمىي RNA ئايرىلىش زاپچاسلىرى.كېيىنكىسى پولىساخارىد ۋە پولىفېنول مىقدارى يۇقىرى ئۆسۈملۈكلەر ئۈچۈن ئالاھىدە لايىھەلەنگەن.RNA ئېلىش ئۈچۈن تەجرىبىخانا ئىشلەتكۈچىلەرنىڭ ئىنكاسى ئالاھىدە ياخشى.
12. ئەۋرىشكە توڭلىتىش ۋە ئېرىتىشنىڭ ئۈنۈمى توڭلىتىلغان ئەۋرىشكە تېخىمۇ چوڭ بولۇشى مۇمكىن ، ئۇنى RNA ئېلىشتا ئىشلىتىشتىن بۇرۇن كېسىش كېرەك.ئەۋرىشكەلەر كېسىش جەريانىدا ئېرىپ كېتىدۇ (بەلكىم قىسمەن بولۇشى مۇمكىن).توڭلىتىلغان ئەۋرىشكىلەرنى RNA ئېلىشتىن بۇرۇن ئۆلچەشكە توغرا كېلىشى مۇمكىن ، بۇ جەرياندا چوقۇم ئېرىتىش يۈز بېرىدۇ.بەزىدە ، ئەۋرىشكە ئېرىتىش سۇيۇق ئازوت زاۋۇتى جەريانىدا يۈز بېرىدۇ.ياكى توڭلىتىلغان ئەۋرىشكە سۇيۇق ئازوت زاۋۇتىسىز لىزاتقا بىۋاسىتە قوشۇلىدۇ ، ئېرىتىش چوقۇم تولۇق بىرىكتۈرۈشتىن بۇرۇن يۈز بېرىدۇ.تەجرىبە شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، توڭلىتىلغان توقۇلمىلار يېڭى توقۇلمىلارغا قارىغاندا ئېرىگەندە RNA نىڭ بۇزۇلۇشىغا ئاسان ئۇچرايدۇ.ئېھتىماللىق سەۋەبى: توڭلىتىش ئېرىتىش جەريانى ھۈجەيرە ئىچىدىكى قۇرۇلمىلارنى قالايمىقانلاشتۇرۇپ ، ئىچكى فېرمېنتلارنىڭ RNA بىلەن بىۋاسىتە ئۇچرىشىشىنى ئاسانلاشتۇرىدۇ.
13. RNA سۈپىتىگە ھۆكۈم قىلىش ئادەتتە ، ئېلېكتروفورېز RNA نىڭ مۇكەممەللىكىگە ھۆكۈم قىلىش ئۈچۈن ، A260 / A280 RNA نىڭ ساپلىقىغا ھۆكۈم قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.نەزەرىيە جەھەتتىن ، مۇكەممەل RNA نىڭ نىسبىتى 28S: 18S = 2.7: 1 بولۇپ ، كۆپىنچە سانلىق مەلۇماتلار 28S: 18S = 2: 1 نىڭ نىسبىتىنى تەكىتلەيدۇ.ئەمەلىيەت شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ھۈجەيرىلەردىن باشقا ئەۋرىشكىلەردىن ئېلىنغان RNA نىڭ ھېچقايسىسى 2: 1 نىسبەتتە ئەمەس (بۇ Agilent Bioanalyzer ئارقىلىق ئېرىشكەن).
RNA نىڭ ئېلېكتروفورېز نەتىجىسى نۇرغۇن ئامىللارنىڭ تەسىرىگە ئۇچرايدۇ ، مەسىلەن ئىككىلەمچى قۇرۇلما ، ئېلېكترو فورېز شارائىتى ، ئەۋرىشكە يۈكى ، EB نىڭ تويۇنۇش دەرىجىسى قاتارلىقلار.ئەگەر 28S 2kb ، 18S بولسا 0.9kb ئېنىق بولسا ، 28S: 18S> 1 بولسا ، سەمىمىيەت كېيىنكى سىناقلارنىڭ تەلىپىگە ماسلىشالايدۇ.
A260 / A280 نۇرغۇن قالايمىقانچىلىقلارنى كەلتۈرۈپ چىقارغان كۆرسەتكۈچ.ئالدى بىلەن ، بۇ كۆرسەتكۈچنىڭ يادرو كىسلاتاسىغا بولغان ئەسلى مەنىسىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش كېرەك: ساپ RNA ، ئۇنىڭ A260 / 280 = تەخمىنەن 2.0.ساپ RNA بولسا «سەۋەب» ، A260 / A280 = 2 بولسا «ئۈنۈم».ھازىر ھەممەيلەن A260 / A280 نى «سەۋەب» قىلىپ ئىشلىتىپ ، «ئەگەر A260 / A280 = 2 بولسا ، ئۇنداقتا RNA ساپ» دەپ ئويلايدۇ ، بۇ تەبىئىيلا قالايمىقانچىلىقنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
ئەگەر قىزىقسىڭىز ، RNA ئەۋرىشكىسىگە فېنول ، گانىدىن ئىزوتىئوكيانات ، PEG قاتارلىق ئېلىشتا دائىم ئىشلىتىلىدىغان ئازراق رېئاكتورنى قوشسىڭىز بولىدۇ ، ئاندىن A260 / A280 نىسبىتىنى ئۆلچەڭ.ئەمەلىيەت شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، RNA ئېلىشتا ئىشلىتىلىدىغان نۇرغۇن رېئاكتورلار ، شۇنداقلا ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى نۇرغۇن بۇلغانمىلار A260 ۋە A280 ئەتراپىدا سۈمۈرۈلۈپ ، A260 / A280 غا تەسىر كۆرسىتىدۇ.
ھازىر ئەڭ ئىبرەتلىك ئۇسۇل 200-300 nm ئارىلىقىدىكى RNA ئەۋرىشكىسىنى سايىلەش.ساپ RNA نىڭ ئەگرى سىزىقى تۆۋەندىكىدەك ئالاھىدىلىكلەرگە ئىگە: ئەگرى سىزىق سىلىق ، A230 ۋە A260 ئىككى بۇرۇلۇش نۇقتىسى ، A300 0 گە يېقىن ، A260 / A280 = 2.0 ئەتراپىدا ، A260 / A230 = 2.0 ئەتراپىدا.ئەگەر سىكانىرلاش سانلىق مەلۇماتلىرى بولمىسا ، A260 / A230 نىسبىتىنىمۇ جەزملەشتۈرۈش كېرەك ، چۈنكى بۇ نىسبەت فېرمېنتنىڭ ئىنكاسىغا تەسىر كۆرسىتىدىغان بارلىق بۇلغانمىلارنىڭ توشۇلۇشىغا تېخىمۇ سەزگۈر.ئۈسكۈنىنىڭ سىزىقلىق دائىرىسىنى ئويلاڭ (A260 نىڭ 0.1–0.5).
باشقا ئىككى پايدىلىق ھادىسە بار: A260 / A280 سۇدا ئۆلچىگەندە بۇ نىسبەت تەخمىنەن 0.3 تۆۋەن بولىدۇ.10MM EDTA بىلەن ئۆلچەنگەن نىسبىتى 1MM EDTA بىلەن سېلىشتۇرغاندا تەخمىنەن 0.2 يۇقىرى.
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:
جۇڭگو زاۋۇتى ئومۇمىي RNA يېگانە زاپچاس ئىشلەپچىقارغۇچى ۋە تەمىنلىگۈچى |Foregene (foreivd.com)
RNA ئايرىلىش يۈرۈشلۈكى - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
يوللانغان ۋاقتى: Jul-15-2022
