一 reaction ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ سەزگۈرلۈكىنى ئاشۇرۇش ：

1. يۇقىرى سۈپەتلىك RNA

مۇۋەپپەقىيەتلىك cDNA بىرىكتۈرۈش يۇقىرى سۈپەتلىك RNA دىن كېلىدۇ.ئەلا سۈپەتلىك RNA ھېچ بولمىغاندا تولۇق ئۇزۇنلۇقتا بولۇشى ھەمدە EDTA ياكى SDS قاتارلىق تەتۈر كۆچۈرۈلۈش چەكلىمىسىدىن خالىي بولۇشى كېرەك.RNA نىڭ سۈپىتى سىز cDNA غا كۆچۈرەلەيدىغان تەرتىپ ئۇچۇرلىرىنىڭ ئەڭ چوڭ مىقدارىنى بەلگىلەيدۇ.كۆپ ئۇچرايدىغان RNA تازىلاش ئۇسۇلى گانىدىن ئىزوتىئوكيانات / كىسلاتا فېنولنى ئىشلىتىپ بىر باسقۇچلۇق ئۇسۇل.كۆپ مىقداردىكى RNase نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ، RNase مول ئەۋرىشكە (ئاشقازان ئاستى بېزىگە ئوخشاش) دىن ئايرىلغان RNA فورمالدېگىدتا ساقلىنىپ ، يۇقىرى سۈپەتلىك RNA نى ساقلاش كېرەك ، بولۇپمۇ ئۇزۇن مۇددەت ساقلاش كېرەك.چاشقان جىگىرىدىن ئېلىنغان RNA بىر ھەپتە سۇدا ساقلانغاندىن كېيىن ئاساسىي جەھەتتىن ناچارلاشقان ، چاشقان تاللىرىدىن ئېلىنغان RNA سۇدا 3 يىل ساقلانغاندىن كېيىن مۇقىم تۇرغان.بۇنىڭدىن باشقا ، 4 kb دىن ئۇزۇن بولغان خاتىرىلەر كىچىك خاتىرىگە قارىغاندا RNases نىڭ ئىز-دېرىكىنىڭ بۇزۇلۇشىغا تېخىمۇ سەزگۈر.ساقلانغان RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ مۇقىملىقىنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، RNA نى دىئونسىزلانغان فورمامىددا ئېرىتىپ ، ° C 70 قا ساقلىغىلى بولىدۇ.RNA نى ساقلاشتا ئىشلىتىلىدىغان فورمامىد چوقۇم RNA نى تۆۋەنلىتىدىغان ئەخلەتلەردىن خالىي بولۇشى كېرەك.ئاشقازان ئاستى بېزىدىكى RNA نى كەم دېگەندە بىر يىل ساقلىغىلى بولىدۇ.RNA نى ئىشلىتىشكە تەييارلىق قىلغاندا ، تۆۋەندىكى ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ RNA نى چۆكتۈرەلەيسىز: NaCl نى 0.2M ۋە ئېتانولنىڭ مىقدارىنىڭ 4 ھەسسىسىگە قوشۇڭ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 3-5 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ ، 10 مىنۇت × گرامدىن 5 مىنۇتقىچە مەركەزلەشتۈرۈڭ.

2. RNaseH ئاكتىپسىز (RNaseH-) تەتۈر كۆچۈرۈلمە ئىشلىتىڭ ：

RNase چەكلىگۈچ كۆپىنچە تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىغا قوشۇلۇپ ، cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئۇزۇنلۇقى ۋە ھوسۇلىنى ئاشۇرىدۇ.بۇففېر ۋە ئازايتقۇچى ۋاكالەتچى (DTT غا ئوخشاش) بىرىنچى قاتاردىكى بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسى جەريانىدا RNase چەكلىگۈچنى قوشۇش كېرەك ، چۈنكى cDNA بىرىكتۈرۈشتىن بۇرۇنقى جەريان چەكلىگۈچنى رەتلەيدۇ ، بۇ ئارقىلىق RNA نى تۆۋەنلىتىدىغان باغلانغان RNase نى قويۇپ بېرىدۇ.ئاقسىل RNase چەكلىگۈچ پەقەت RNase A ، B ، C نىڭ RNA نىڭ بۇزۇلۇشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ، ھەمدە تېرىدىكى RNase نىڭ ئالدىنى ئالمايدۇ ، شۇڭا بۇ چەكلەش دورىلىرىنى ئىشلەتكەن بولۇشىغا قارىماي بارمىقىڭىزدىن RNase نى تونۇشتۇرماسلىققا دىققەت قىلىڭ.

تەتۈر كۆچۈرۈلۈش RNA نىڭ cDNA غا ئايلىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ.M-MLV ۋە AMV ھەر ئىككىلىسىنىڭ ئۆزلۈكىدىن كۆپ قۇتۇپلىشىش پائالىيىتىدىن باشقا ، ئۆزلۈكىدىن RNaseH پائالىيىتى بار.RNaseH پائالىيىتى ۋە پولىمېرازا پائالىيىتى RNA قېلىپى بىلەن DNA كۆرسەتكۈچى ياكى cDNA كېڭەيتىش بەلبېغى ئوتتۇرىسىدا شەكىللەنگەن ئارىلاشما بەلۋاغ ئۈچۈن ئۆز-ئارا رىقابەتلىشىدۇ ۋە RNA: DNA گۇرۇپپىسىدىكى RNA يولىنى تۆۋەنلىتىدۇ.RNaseH پائالىيىتى تەرىپىدىن بۇزۇلغان RNA ئەندىزىسى ئەمدى cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئۈنۈملۈك تارماق رولىنى ئوينايدۇ ، بۇ cDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ مەھسۇلات مىقدارى ۋە ئۇزۇنلۇقىنى تۆۋەنلىتىدۇ.شۇڭلاشقا ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNaseH پائالىيىتىنى يوقىتىش ياكى زور دەرىجىدە ئازايتىش پايدىلىق .。

SuperScript Ⅱ تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ، RNaseH- MMLV تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىسى ۋە thermoScript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ، RNaseH- AMV ، MMLV ۋە AMV غا قارىغاندا تېخىمۇ كۆپ ۋە تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA غا ئېرىشەلەيدۇ.RT-PCR سەزگۈرلۈكى cDNA بىرىكتۈرۈش مىقدارىنىڭ تەسىرىگە ئۇچرايدۇ.ThermoScript AMV غا قارىغاندا تېخىمۇ سەزگۈر.RT-PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ چوڭلۇقى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ cDNA نى بىرىكتۈرۈش ئىقتىدارى بىلەن چەكلىنىدۇ ، بولۇپمۇ چوڭراق CDNA نى كلونلىغاندا.MMLV غا سېلىشتۇرغاندا ، SuperScripⅡ ئۇزۇن RT-PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى كۆرۈنەرلىك ئاشۇردى.RNaseH تەتۈر ترانسكرىپسىيەسىمۇ ئىسسىقلىق تارقىتىشچانلىقىنى ئاشۇردى ، شۇڭا نورمال 37-42 سېلسىيە گرادۇستىن يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ئىنكاس قايتۇرغىلى بولىدۇ.تەۋسىيە قىلىنغان سىنتېزلاش شارائىتىدا ، oligo (dT) پىرىمېر ۋە 10 μCi [α-P] dCTP نى ئىشلىتىڭ.بىرىنچى تالنىڭ ئومۇمىي مەھسۇلات مىقدارى TCA يامغۇر يېغىش ئۇسۇلى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA چوڭ-كىچىكلىكى تەرتىپلەنگەن بەلۋاغلار ئارقىلىق ئانالىز قىلىنىپ ، ئىشقارلىق ئاگاروزا گېلىغا سانالغان.

3. تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ يوشۇرۇن تېمپېراتۇرىسىنى ئۆرلىتىڭ ：

تېخىمۇ يۇقىرى يوشۇرۇن تېمپېراتۇرا RNA ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى ئېچىشقا ياردەم بېرىپ ، ئىنكاسنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرىدۇ.كۆپىنچە RNA قېلىپىغا نىسبەتەن ، RNA ۋە پىرىمېرنى ° C 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق بۇففېر ياكى تۇزسىز سىڭدۈرگەندىن كېيىن ، مۇزدا تېز سوۋۇتۇش كۆپىنچە ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلارنى يوقىتىدۇ ۋە پىرىمېرلارنىڭ باغلىنىشىغا يول قويىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، بەزى قېلىپلاردا ئىسسىقلىق تۆۋەنلىگەندىن كېيىنمۇ ئىككىنچى دەرىجىلىك قۇرۇلمىلار بار.بۇ قىيىن قېلىپلارنى كۈچەيتىش ThermoScript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ئارقىلىق تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىنكاسىنى تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىغا قويۇپ ، كۈچەيتكۈچنى ياخشىلىغىلى بولىدۇ.ئىنكۇباتسىيەنىڭ يۇقىرى تېمپېراتۇرىسىمۇ ئېنىقلىقنى ئاشۇرالايدۇ ، بولۇپمۇ cDNA بىرىكتۈرۈشتە گېنغا خاس پىرىسلار (GSP) ئىشلىتىلگەندە (3-بابقا قاراڭ).ئەگەر GSP ئىشلىتىۋاتقان بولسىڭىز ، پىرىمېرلارنىڭ Tm نىڭ مۆلچەردىكى يوشۇرۇن تېمپېراتۇرا بىلەن ئوخشاش بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.ئولىگو (dT) ۋە 60 سېلسىيە گرادۇستىن يۇقىرى ئىختىيارى پىرىمېرلارنى ئىشلەتمەڭ.ئىختىيارى پىرىمېرلار ° C60 قا ئۆرلەشتىن بۇرۇن 25 سېلسىيە گرادۇسلۇق 10 مىنۇت ئىچىدە ئىنكۇبلاشنى تەلەپ قىلىدۇ.تېخىمۇ يۇقىرى تەتۈر ترانسكرىپسىيە تېمپېراتۇرىسىنى ئىشلەتكەندىن باشقا ، RNA / primer ئارىلاشمىسىنى 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق تۆۋەن تېمپېراتۇرادىن تەتۈر ترانسكرىپسىيە يوشۇرۇن تېمپېراتۇرىسىغا بىۋاسىتە يۆتكەش ۋە ئالدىن قىزىتىلغان 2 × رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى (cDNA قىزىق باشلاش بىرىكمىسى) نى قوشۇش ئارقىلىق ، كونكرېتلىقنى ياخشىلىغىلى بولىدۇ.بۇ خىل ئۇسۇل تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا يۈز بېرىدىغان ئارىلىق ئارىلىقىدىكى ئاساسى جۈپلىشىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.RT-PCR غا ئېھتىياجلىق بولغان كۆپ خىل تېمپېراتۇرا ئالماشتۇرۇشنى ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىت ئىشلىتىش ئارقىلىق ئاددىيلاشتۇرغىلى بولىدۇ.

Tth ئىسسىقلىق ساقلاش پولىمېراسى Mg2 + نىڭ ئالدىدا DNA پولىمېراسى ۋە Mn2 + نىڭ ئالدىدا RNA پولىمېراسى رولىنى ئوينايدۇ.ئۇنى ئەڭ يۇقىرى تېمپېراتۇرا ° 65 تىن يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ساقلىغىلى بولىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، PCR مەزگىلىدە Mn2 + نىڭ بولۇشى ساداقەتمەنلىكنى تۆۋەنلىتىدۇ ، بۇ Tth پولىمېرازانىڭ cDNA نى كلونلاش قاتارلىق يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى كۈچەيتىشكە ماس كەلمەيدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، Tth نىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى تۆۋەن بولۇپ ، سەزگۈرلۈكنى تۆۋەنلىتىدۇ ، ھەمدە تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە PCR نى بىر خىل ئېنزىم بىلەن قىلغىلى بولىدىغان بولغاچقا ، تەتۈر كۆچۈرۈلمەي كونترول رېئاكسىيەسىنى cDNA كۈچەيتمە مەھسۇلاتلىرى بىلەن گېننىڭ DNA نى بۇلغىغان سېلىشتۇرۇشقا ئىشلىتىشكە بولمايدۇ.كۈچەيتمە مەھسۇلاتلار ئايرىلدى.

4. تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنى ئىلگىرى سۈرىدىغان خۇرۇچلار ：

گلىتسېرىن ۋە DMSO نى ئۆز ئىچىگە ئالغان خۇرۇچلار بىرىنچى قاتاردىكى بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىگە قوشۇلدى ، بۇ يادرو كىسلاتاسىنىڭ قوش سىزىقنىڭ مۇقىملىقىنى تۆۋەنلىتىدۇ ۋە RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى يېشىپ بېرىدۇ.SuperScript II ياكى MMLV پائالىيىتىگە تەسىر كۆرسەتمەيلا% 20 لىك گلىتسېرىن ياكى% 10 DMSO نى قوشقىلى بولىدۇ.AMV يەنە پائالىيەتنى قولدىن بەرمەي% 20 لىك گلىتسېرىنغا بەرداشلىق بېرەلەيدۇ.SuperScriptⅡ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش رېئاكسىيەسىدىكى RT-PCR نىڭ سەزگۈرلۈكىنى ئەڭ يۇقىرى چەكتە ئاشۇرۇش ئۈچۈن ،% 10 گلىتسېرىننى 45 سېلسىيە گرادۇسقا قوشقىلى ۋە سىڭدۈرگىلى بولىدۇ.ئەگەر تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكسىيە مەھسۇلاتىنىڭ 1/10 ى PCR غا قوشۇلسا ، ئۇنداقتا كۈچەيتكۈچ رېئاكسىيەسىدىكى گلىتسېرىننىڭ قويۇقلۇقى% 0.4 بولىدۇ ، بۇ PCR نى چەكلەشكە يەتمەيدۇ.

5. RNaseH داۋالاش ：

PCR دىن بۇرۇن RNaseH بىلەن cDNA بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىنى داۋالاش سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرالايدۇ.بەزى قېلىپلارغا نىسبەتەن ، cDNA بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىدىكى RNA كۈچەيتمە مەھسۇلاتلارنىڭ باغلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ دەپ قارىلىدۇ ، بۇنداق بولغاندا RNaseH داۋالاش سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرالايدۇ.ئادەتتە ، ئۇزۇن كۆپەيتىلگەن CDNA نىشان قېلىپىنى كۈچەيتكەندە ، RNaseH نى داۋالاش زۆرۈر ، مەسىلەن تۆۋەن كۆپەيتىلگەن تۇبېركۇليوز II.بۇ قىيىن قېلىپقا نىسبەتەن ، RNaseH داۋالاش SuperScript II ياكى AMV بىرىكتۈرۈلگەن cDNA ئىشلەپچىقارغان سىگنالنى كۈچەيتتى.كۆپىنچە RT-PCR ئىنكاسىغا نىسبەتەن ، RNaseH نى داۋالاش ئىختىيارىي بولىدۇ ، چۈنكى 95 سېلسىيە گرادۇسلۇق PCR ئايرىش باسقۇچى ئادەتتە RNA: DNA گۇرۇپپىسىدىكى RNA نى ھىدرولىزلايدۇ.

6. كىچىك RNA بايقاش ئۇسۇلىنى ياخشىلاش ：

RT-PCR پەقەت ئاز مىقداردا RNA ئىشلەتكىلى بولىدۇ.گلىكوگېن RNA ئايرىغاندا توشۇغۇچى سۈپىتىدە قوشۇلۇپ ، كىچىك ئەۋرىشكىلەرنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ.Trizol نى قوشۇش بىلەن بىر ۋاقىتتا RNase بولمىغان گلىكوگېننى قوشقىلى بولىدۇ.گلىكوگېن سۇدا ئېرىيدىغان بولۇپ ، RNA بىلەن سۇ باسقۇچىدا ساقلىنىپ ، كېيىنكى ھۆل-يېغىنغا ياردەم بېرەلەيدۇ.50 مىللىگىرامدىن تۆۋەن توقۇلمىلار ياكى 106 مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىگە نىسبەتەن ، RNase يوق گلىكوگېننىڭ تەۋسىيە قىلىنغان قويۇقلۇقى 250 mg / ml.

SuperScript II ئارقىلىق تەتۈر كۆچۈرۈلگەن رېئاكسىيەگە ئاتسېتىللانغان BSA نى قوشقاندا سەزگۈرلۈكنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ ، ئاز مىقداردىكى RNA غا نىسبەتەن ، SuperScript II نىڭ مىقدارىنى ئازايتىپ ، 40 دانە RNaseOut يادروسى چەكلىگۈچنى قوشقاندا بايقاش دەرىجىسىنى ئۆستۈرگىلى بولىدۇ.ئەگەر گلىكوگېن RNA ئايرىۋېتىش جەريانىدا ئىشلىتىلگەن بولسا ، SuperScript II نى تەتۈر كۆچۈرۈش رېئاكسىيەسى ئىشلەتكەندە يەنىلا BSA ياكى RNase چەكلىگۈچ قوشۇش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

RT RT RT-PCR خاسلىقىنى ئاشۇرۇش

1. CND ئاسسىمىلياتسىيە ：

بىرىنچى قاتاردىكى cDNA بىرىكتۈرۈشنى ئوخشىمىغان ئۈچ خىل ئۇسۇل ئارقىلىق قوزغىتىشقا بولىدۇ ، بۇنىڭ نىسپىي ئالاھىدىلىكى CDNA بىرىكتۈرۈلگەن مىقدار ۋە تۈرگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.

تاسادىپىي دەسلەپكى ئۇسۇل ئۈچ خىل ئۇسۇلنىڭ ئىچىدە ئەڭ ئاز بولغان.دەسلەپكى خاتىرىلەر بىر نەچچە بېكەتتە قوشۇمچە بولۇپ ، قىسقا ، قىسمەن ئۇزۇنلۇقتىكى cDNA ھاسىل قىلىدۇ.بۇ ئۇسۇل 5 ′ ئاخىرقى تەرتىپكە ئېرىشىش ۋە ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونلىرى ياكى تەتۈر كۆچۈرۈلمە ئارقىلىق كۆپەيتكىلى بولمايدىغان ئاخىرلىشىش تور بېكەتلىرى بىلەن RNA قېلىپىدىن cDNA ئېلىش ئۈچۈن دائىم ئىشلىتىلىدۇ.ئەڭ ئۇزۇن cDNA غا ئېرىشىش ئۈچۈن ، ھەر بىر RNA ئەۋرىشكىسىدىكى پىرىمېرلارنىڭ RNA بىلەن بولغان نىسبىتىنى تەجرىبە جەھەتتىن ئېنىقلاش كېرەك.ئىختىيارى پىرىمېرلارنىڭ باشلىنىش قويۇقلۇقى 20 مىللىمېتىر رېئاكسىيەدە 50 دىن 250 ng ئارىلىقىدا.تاسادىپىي پرېرمېر ئارقىلىق ئومۇمىي RNA دىن بىرىكتۈرۈلگەن cDNA ئاساسلىقى رىبوسومال RNA بولغاچقا ، پولى (A) + RNA ئادەتتە قېلىپ قىلىپ تاللىنىدۇ.

Oligo (dT) پىرىمېرلىرى تاسادىپىي پىرىسلارغا قارىغاندا تېخىمۇ كونكرېت.ئۇ كۆپىنچە ئېۋكارىئوتىك mRNA نىڭ 3 ′ ئۇچىدىن تېپىلغان پولى (A) قۇيرۇقىغا بىرىكىدۇ.كۆپ قۇتۇپلۇق (A) + RNA ئومۇمىي RNA نىڭ تەخمىنەن% 1 تىن% 2 كىچە بولغانلىقى ئۈچۈن ، cDNA نىڭ مىقدارى ۋە مۇرەككەپلىكى ئىختىيارى پىرىمېرلارغا قارىغاندا كۆپ تۆۋەن.يۇقىرى ئېنىقلىق دەرىجىسى بولغاچقا ، oligo (dT) ئادەتتە RNA نىڭ دەسلەپكى ۋە پولى (A) + تاللاش نىسبىتىنى ئەلالاشتۇرۇشنى تەلەپ قىلمايدۇ.ھەر 20μl رېئاكسىيە سىستېمىسىغا 0.5μg oligo (dT) ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.oligo (dT) 12-18 كۆپىنچە RT-PCR غا ماس كېلىدۇ.ThermoScript RT-PCR سىستېمىسى ئولىگو (dT) 20 بىلەن تەمىنلەيدۇ ، چۈنكى ئۇ تېخىمۇ يۇقىرى يوشۇرۇن تېمپېراتۇرا ئۈچۈن ئىسسىقلىق مۇقىملىقى ياخشى.

گېن ئالاھىدە پىرىسلاش (GSP) بولسا تەتۈر كۆچۈرۈش باسقۇچىدىكى ئەڭ كونكرېت دەسلەپكى تاللاش.GSP ئانتىتېلاغا قارشى ئولېگونۇكلېئوتىد بولۇپ ، RNA نىشان تەرتىپىگە ئالاھىدە بىرىكتۈرەلەيدۇ ، تاسادىپىي پىرىمېر ياكى oligo (dT) غا ئوخشىمايدۇ ، ئۇ بارلىق RNA لارغا تۇتىشىدۇ.PCR پىرىمېرلىرىنى لايىھىلەشتە قوللىنىلغان ئوخشاش قائىدىلەر تەتۈر ترانسكرىپسىيە رېئاكسىيەسىدىكى GSP لايىھىسىگە قوللىنىلىدۇ.GSP mRNA نىڭ 3 ′ ئەڭ ئاخىرقى ئۇچىغا تۇتىشىدىغان كۈچەيتكۈچ كۆرسەتكۈچ بىلەن ئوخشاش تەرتىپ بولالايدۇ ، ياكى GSP تەتۈر كۈچەيتكۈچنىڭ تۆۋەنكى ئېقىمىغا تۇتاشتۇرۇلسا بولىدۇ.بەزى كۈچەيتىلگەن سۇبيېكتلارغا نىسبەتەن ، مۇۋەپپەقىيەتلىك RT-PCR ئۈچۈن بىردىن كۆپ ۋىرۇسقا قارشى تۇرۇش لايىھىسىنى لايىھىلەش كېرەك ، چۈنكى نىشان RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسى دەسلەپكى باغلىنىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.20 مىللىمېتىرلىق بىرىنچى رەت بىرىكتۈرۈش رېئاكسىيەسىدە چۈشتىن كېيىن سائەت 1 گە قارشى GSP ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

2. تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ يوشۇرۇن تېمپېراتۇرىسىنى ئۆرلىتىڭ ：

GSP ئۆلچىمىنىڭ تولۇق ئەۋزەللىكىدىن تولۇق پايدىلىنىش ئۈچۈن ، ئىسسىقلىق ساقلاش ئىقتىدارى يۇقىرى بولغان تەتۈر كۆچۈرۈلمە ئىشلىتىش كېرەك.تېرموستال تەتۈر كۆچۈرۈلگەن خاتىرىلەرنى تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا سىڭدۈرۈپ ، ئىنكاسنىڭ قاتتىقلىقىنى ئاشۇرغىلى بولىدۇ.مەسىلەن ، ئەگەر GSP 55 سېلسىيە گرادۇستا تۇتاشتۇرۇلسا ، ئەگەر AMV ياكى M-MLV تۆۋەن تېمپېراتۇرا 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق تەتۈر كۆچۈرۈلۈشكە ئىشلىتىلسە ، GSP نىڭ ئالاھىدىلىكى تولۇق ئىشلىتىلمەيدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، SuperScript II ۋە ThermoScript نى ° C50 ياكى ئۇنىڭدىن يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ئىنكاس قايتۇرغىلى بولىدۇ ، بۇ تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ھاسىل بولغان ئالاھىدە مەھسۇلاتلارنى يوقىتىدۇ.ئەڭ چوڭ ئېنىقلىق ئۈچۈن ، RNA / primer ئارىلاشمىسىنى بىۋاسىتە ° C 65 تىن تۆۋەن تېمپېراتۇرادىن تەتۈر ترانسكرىپسىيە يوشۇرۇن تېمپېراتۇرىسىغا يۆتكىگىلى ھەمدە ئالدىن قىزىتىلغان 2 × رېئاكسىيە ئارىلاشمىسىغا قوشقىلى بولىدۇ (cDNA بىرىكتۈرۈش قىزىق باشلىنىش).بۇ تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ئۆز-ئارا ئاساسىي جۈپلىشىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.RT-PCR ئۈچۈن تەلەپ قىلىنغان كۆپ خىل تېمپېراتۇرا ئۆتكۈنچىسىنى ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىت ئىشلىتىش ئارقىلىق ئاددىيلاشتۇرغىلى بولىدۇ.

3. گېن گۇرۇپپىسىنىڭ بۇلغىنىشىنى ئازايتىدۇ ：

RT-PCR دۇچ كەلگەن يوشۇرۇن قىيىنچىلىق RNA دىكى گېن گۇرۇپپىسىنىڭ بۇلغىنىشى.Trizol Reagent غا ئوخشاش ياخشى بولغان RNA ئايرىۋېتىش ئۇسۇلىنى قوللانسا ، RNA تەييارلىقىنى بۇلغايدىغان گېن گۇرۇپپىسىنىڭ مىقدارىنى ئازايتىدۇ.گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA دىن ھاسىل بولغان مەھسۇلاتلاردىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، RNA نى كۈچەيتىش دەرىجىسى DNase I ئارقىلىق داۋالىغىلى بولىدۇ.DNase I ھەزىم قىلىش ئەۋرىشكىسىنى 2.0 mM EDTA دىكى 10 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت سىڭدۈرۈش ئارقىلىق ئاخىرلاشتۇردى.EDTA ماگنىي ئىئونلىرىنى خىلىتلاپ ، يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا ماگنىي ئىئونىغا تايىنىدىغان RNA گىدرولىزنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.

كۈچەيتىلگەن cDNA نى گېننىڭ DNA كېڭەيتىش مەھسۇلاتلىرىنى بۇلغىنىشتىن ئايرىش ئۈچۈن ، ھەر بىر ئۇلانمىنى تاشقى ھۈجەيرىلەرگە ئايرىپ لايىھىلەپ چىقالايدۇ.CDNA دىن ھاسىل قىلىنغان PCR مەھسۇلاتلىرى بۇلغانغان گېن گۇرۇپپىسىدىن قىسقا بولىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، ھەر بىر RNA قېلىپىدا تەتۈر كۆچۈرۈلمەي كونترول قىلىش تەجرىبىسى ئېلىپ بېرىلىپ ، بېرىلگەن بۆلەكنىڭ گېن DNA ياكى CDNA دىن ئېلىنغان ياكى چىقمىغانلىقى ئېنىقلاندى.تەتۈر كۆچۈرۈلمەي ئېرىشكەن PCR مەھسۇلاتى گېندىن كەلگەن.