1. ئاساسىي بىلىملەر (ئەگەر تەجرىبە قىسمىنى كۆرمەكچى بولسىڭىز ، ئىككىنچى بۆلەككە بىۋاسىتە يۆتكەڭ)
ئادەتتىكى PCR نىڭ تۇغۇندى ئىنكاسى بولۇش سۈپىتى بىلەن ، ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئاساسلىقى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ ئۆزگىرىشى ئارقىلىق PCR كېڭەيتىش رېئاكسىيەسىنىڭ ھەر بىر دەۋرىيلىكىدىكى كۈچەيتمە مەھسۇلات مىقدارىنىڭ ئۆزگىرىشىنى نازارەت قىلىدۇ ، ھەمدە ct قىممىتى بىلەن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئوتتۇرىسىدىكى مۇناسىۋەت ئارقىلىق باشلىنىش قېلىپىنى مىقدارلاشتۇرۇپ تەھلىل قىلىدۇ.
RT-PCR نىڭ كونكرېت سانلىق مەلۇماتلىرىئاساسىي سىزىق, فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسىۋەCt قىممىتى.
| ئاساسىي سىزىق: | 3-15-دەۋرىيلىكنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى ئاساسىي ئۆلچەم (ئاساسىي سىزىق) بولۇپ ، ئۆلچەشتە ئاندا-ساندا خاتالىق كېلىپ چىقىدۇ. |
| چەك چېكى (بوسۇغىسى): | كۈچەيتمە ئەگرى سىزىقنىڭ تېز سۈرئەتتە ئۆسۈش رايونىدا مۇۋاپىق ئورۇنغا قويۇلغان فلۇئورېسسېنسىيەنى تەكشۈرۈش چەكلىمىسىنى كۆرسىتىدۇ ، ئادەتتە ئاساسىي سىزىقنىڭ ئۆلچەملىك ئېغىشىنىڭ 10 ھەسسىسىگە تەڭ. |
| CT قىممىتى: | ئۇ ھەر بىر رېئاكسىيە تۇرۇبىسىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى بوسۇغىغا يەتكەندە PCR دەۋرىيلىكىنىڭ سانى. Ct قىممىتى دەسلەپكى قېلىپنىڭ مىقدارى بىلەن تەتۈر تاناسىپ بولىدۇ. |
RT-PCR نىڭ ئورتاق بەلگە قويۇش ئۇسۇللىرى:
| method | ئەۋزەللىكى | كەمچىل | قوللىنىش دائىرىسى |
| SYBR GreenⅠ | كەڭ قوللىنىشچانلىقى ، سەزگۈر ، ئەرزان ۋە قۇلايلىق | دەسلەپكى تەلەپ يۇقىرى ، ئالاھىدە بەلۋاغقا مايىل | ئۇ ھەر خىل نىشانلىق گېنلارنى مىقدارلاشتۇرۇپ تەھلىل قىلىشقا ، گېننىڭ ئىپادىلىنىشى ۋە گېنى يۆتكەلگەن ھايۋانلار ۋە ئۆسۈملۈكلەر تەتقىقاتىغا ماس كېلىدۇ. |
| TaqMan | ياخشى ئېنىقلىق ۋە تەكرارلىنىشچانلىقى يۇقىرى | باھاسى يۇقىرى ، پەقەت كونكرېت نىشانلارغا ماس كېلىدۇ. | كېسەللىك قوزغاتقۇچنى بايقاش ، دورىغا چىداملىق گېن تەتقىقاتى ، دورا ئۈنۈمىنى باھالاش ، ئىرسىيەت كېسەللىكلىرىگە دىئاگنوز قويۇش. |
| مولېكۇلا ماياك | يۇقىرى ئېنىقلىق ، فلۇئورېسسېنسىيە ، تۆۋەن تەگلىك | باھاسى يۇقىرى ، ئۇ پەقەت مەلۇم بىر مەقسەتكە ماس كېلىدۇ ، لايىھىلەش تەس ، باھاسىمۇ يۇقىرى. | كونكرېت گېن ئانالىزى ، SNP تەھلىلى |
2. تەجرىبە باسقۇچلىرى
2.1 تەجرىبە گۇرۇپپىلىرى ھەققىدە- گۇرۇپپىدا چوقۇم بىر قانچە قۇدۇق بولۇشى كېرەك ، چوقۇم بىئولوگىيىلىك تەكرارلاش بولۇشى كېرەك.
| ① | ئوچۇق كونترول | تەجرىبىدە ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆسۈپ يېتىلىش ئەھۋالىنى بايقاشقا ئىشلىتىلىدۇ |
| ② | سەلبىي كونترول siRNA (ئېنىق بولمىغان siRNA تەرتىپى) | RNAi ھەرىكىتىنىڭ كونكرېتلىقىنى نامايان قىلىڭ.siRNA بەلكىم 200nM قويۇقلۇقىدا ئالاھىدە بولمىغان بېسىم ئىنكاسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن. |
| ③ | Transaction Reagent Control | ھۈجەيرىلەرگە كۆچۈرۈلگەن رېئاكسىيەنىڭ زەھىرىنى ياكى نىشانلىق گېننىڭ ئىپادىلىنىشىگە بولغان تەسىرىنى چىقىرىۋېتىڭ |
| ④ | نىشان گېنغا قارشى siRNA | نىشان گېننىڭ ئىپادىسىنى بىكار قىلىڭ |
| ⑤ (ئىختىيارىي) | مۇسبەت siRNA | تەجرىبە سىستېمىسى ۋە مەشغۇلات مەسىلىلىرىنى ھەل قىلىشقا ئىشلىتىلىدۇ |
| ⑥ (ئىختىيارىي) | فلۇئورېسسېنسىيەنى كونترول قىلىش siRNA | مىكروسكوپ ئارقىلىق ھۈجەيرە ئالماشتۇرۇشنىڭ ئۈنۈمىنى كۆرگىلى بولىدۇ |
2.2 دەسلەپكى لايىھىلەشنىڭ پرىنسىپلىرى
| چوڭايتىلغان بۆلەك چوڭلۇقى | ئەڭ ياخشىسى 100-150bp |
| Primer Length | 18-25bp |
| GC مەزمۇنى | 30% -70% ، ئەڭ ياخشىسى 45% -55% |
| Tm قىممىتى | 58-60 ℃ |
| تەرتىپ | توختىماي T / C دىن ساقلىنىڭ.A / G ئۈزلۈكسىز |
| 3 ئاخىرقى تەرتىپ | GC باي ياكى AT بايلاردىن ساقلىنىڭ.تېرمىنال ئاساسى ئەڭ ياخشىسى G ياكى C;ئەڭ ياخشىسى T دىن ساقلىنىش كېرەك |
| تولۇقلاش | پىرىزما ئىچىدىكى ياكى ئىككى پىرىمېر ئارىسىدىكى 3 تىن ئارتۇق بازىنى تولۇقلاش تەرتىپىدىن ساقلىنىڭ |
| كونكرېتلىقى | پارتلاش ئىزدەش ئارقىلىق دەسلەپكى خاسلىقنى جەزملەشتۈرۈڭ |
①SiRNA تۈرگە خاس بولۇپ ، ئوخشىمىغان تۈرلەرنىڭ رەت تەرتىپى ئوخشىمايدۇ.
RNASiRNA توڭلىتىلغان قۇرۇتۇلغان پاراشوكقا قاچىلانغان بولۇپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2-4 ھەپتە مۇقىم ساقلىغىلى بولىدۇ.
2.3 ئالدىن تەييارلاشقا تېگىشلىك قورال ياكى رېئاكتور
| Primer (ئىچكى پايدىلىنىش) | ئالدى ۋە كەينىگە ئىككىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ |
| Primers (target gene) | ئالدى ۋە كەينىگە ئىككىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ |
| نىشان Si RNA (3 سىزىق) | ئادەتتە ، شىركەت 3 بەلۋاغنى بىرىكتۈرىدۇ ، ئاندىن RT-PCR تەرىپىدىن ئۈچتىن بىرىنى تاللايدۇ |
| Transfection Kit | Lipo2000 etc. |
| RNA Rapid Extraction Kit | يۆتكەلگەندىن كېيىن RNA ئېلىش ئۈچۈن |
| تېز تەتۈر كۆچۈرۈش زاپچىسى | cDNA بىرىكتۈرۈش ئۈچۈن |
| PCR Amplification Kit | 2 × دەرىجىدىن تاشقىرى SYBR يېشىل qPCR Master Mix |
2.4 كونكرېت تەجرىبە باسقۇچلىرىدا دىققەت قىلىشقا تېگىشلىك مەسىلىلەرگە قارىتا:
①siRNA ئۇلىنىش جەريانى
1. تەخسە ئۈچۈن 24 قۇدۇق تەخسىسى ، 12 قۇدۇق تەخسىسى ياكى 6 قۇدۇق تاختىسىنى تاللىسىڭىز بولىدۇ (24 قۇدۇق تەخسىنىڭ ھەر بىر قۇدۇقىدا ئوتتۇرىغا قويۇلغان ئوتتۇرىچە RNA قويۇقلۇقى تەخمىنەن 100-300 ng / uL) ، ھۈجەيرىلەرنىڭ ئەڭ ياخشى ئۇلىنىش زىچلىقى% 60-% 80 كە يېتىدۇ.
2. يۆتكەش باسقۇچلىرى ۋە كونكرېت تەلەپلەر كۆرسەتمىگە ئاساسەن قاتتىق.
3. يۇقۇملانغاندىن كېيىن ، ئەۋرىشكە 24-72 سائەت ئىچىدە mRNA بايقاش (RT-PCR) ياكى 48-96 سائەت ئىچىدە (WB) ئاقسىلنى تەكشۈرگىلى بولىدۇ.
R RNA ئېلىش جەريانى
1. تاشقى فېرمېنتلارنىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش.ئۇ ئاساسلىقى ماسكا ۋە پەلەي كىيىشنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.مىكروبسىزلاندۇرۇلغان تۇرۇبا ئۇچى ۋە EP تۇرۇبىسىنى ئىشلىتىشسىناقتا ئىشلىتىلگەن سۇ چوقۇم RNase-Free بولۇشى كېرەك.
2. تېز ئېلىش زاپچاسلىرىدا تەۋسىيە قىلىنغاندىن ئىككى قېتىم قىلىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ ، بۇ ساپلىق ۋە ھوسۇلنى ھەقىقىي ئۆستۈرىدۇ.
3. ئەخلەت سۇيۇقلۇقى RNA تۈۋرۈكىگە تەگمەسلىكى كېرەك.
③ RNA مىقدارلاشتۇرۇش
RNA چىقىرىلغاندىن كېيىن ، ئۇنى نانودروپ بىلەن بىۋاسىتە مىقدارلاشتۇرغىلى بولىدۇ ، ئەڭ تۆۋەن ئوقۇش مىقدارى 10ng / ul غا ئوخشاش بولىدۇ.
ترانسكرىپسىيە جەريانىنى ئەسلىگە كەلتۈرۈش
1. RT-qPCR نىڭ سەزگۈرلۈكى يۇقىرى بولغاچقا ، ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن كەم دېگەندە 3 پاراللېل قۇدۇق ياساپ ، كېيىنكى Ct نىڭ بەك پەرقلىنىپ كېتىشىنىڭ ياكى SD نىڭ ئىستاتىستىكا ئانالىزىنىڭ بەك چوڭ بولۇپ كېتىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.
2. ئۇستازنى قايتا-قايتا توڭلاتماڭ.
3. ھەر بىر تۇرۇبا / تۆشۈكنى چوقۇم يېڭى ئۇچى بىلەن ئالماشتۇرۇش كېرەك!داۋاملىق ئوخشاش تۇرۇبا ئۇچىنى ئىشلىتىپ ئەۋرىشكە قوشماڭ!
4. ئەۋرىشكە قوشۇلغاندىن كېيىن 96 قۇدۇق تەخسىگە چاپلانغان پىلاستىنكىنى تەخسە بىلەن سىلىقلاش كېرەك.ئۇنى ماشىنىغا سېلىشتىن بۇرۇن ئەڭ ياخشىسى مەركەزدىن قاچۇرۇش كېرەك ، بۇنداق بولغاندا تۇرۇبا تېمىدىكى سۇيۇقلۇق تۆۋەنلەپ ھاۋادىكى كۆپۈكلەرنى چىقىرىپ تاشلايدۇ.
Om ئادەتتىكى ئەگرى سىزىق ئانالىزى
| لوگارىزىمنىڭ ئۆسۈپ يېتىلىش دەۋرى بولمايدۇ | قېلىپنىڭ يۇقىرى قويۇقلۇقى بولۇشى مۇمكىن |
| CT قىممىتى يوق | فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى بايقاشنىڭ توغرا قەدەملىرى پىرىسلاش ياكى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ بۇزۇلۇشى - ئۇنىڭ پۈتۈنلۈكىنى PAGE ئېلېكترو فورمىسى ئارقىلىق بايقىغىلى بولىدۇ. قېلىپنىڭ يېتەرلىك بولماسلىقى قېلىپلارنىڭ بۇزۇلۇشى - ئەۋرىشكە تەييارلاشتا پاسكىنا ماددىلارنىڭ پەيدا بولۇشى ۋە قايتا-قايتا مۇزلاش ۋە ئېرىتىشتىن ساقلىنىش. |
| Ct> 38 | تۆۋەن كۈچەيتىش ئۈنۈمىPCR مەھسۇلاتى بەك ئۇزۇن.ھەر خىل رېئاكسىيە زاپچاسلىرى بۇزۇلغان |
| سىزىقلىق كېڭەيتىش ئەگرى سىزىقى | قايتا-قايتا مۇزلاش دەۋرىيلىكى ياكى نۇرنىڭ ئۇزۇن مۇددەت تەسىر قىلىشى بىلەن مەسىلىلەر قىسمەن بۇزۇلۇشى مۇمكىن |
| تەكرارلانغان تۆشۈكلەرنىڭ پەرقى ئالاھىدە چوڭ | رېئاكسىيە ھەل قىلىش چارىسى پۈتۈنلەي ئېرىمەيدۇ ياكى ئىنكاس ئېرىتمىسى ئارىلاشتۇرۇلمايدۇPCR ئەسۋابىنىڭ ئىسسىقلىق مۇنچىسى فلۇئورېسسېنسىيە ماددىلىرى بىلەن بۇلغانغان |
2.5 سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ھەققىدە
QPCR نىڭ سانلىق مەلۇمات ئانالىزىنى نىسپىي مىقدار ۋە مۇتلەق مىقدارغا ئايرىشقا بولىدۇ.مەسىلەن ، داۋالاش گۇرۇپپىسىدىكى ھۈجەيرىلەر كونترول گۇرۇپپىسىدىكى ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا ،
X گېنىنىڭ mRNA قانچە قېتىم ئۆزگىرىدۇ ، بۇ نىسپىي مىقدار.مەلۇم ساندىكى ھۈجەيرىلەردە ، X گېنىنىڭ mRNA
قانچە نۇسخا بار ، بۇ مۇتلەق مىقدار.ئادەتتە تەجرىبىخانىدا ئەڭ كۆپ ئىشلىتىدىغىنىمىز نىسپىي مىقدار ئۇسۇلى.ئادەتتە ،2-ΔΔct ئۇسۇلىسىناقلاردا ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدۇ ، شۇڭا بۇ ئۇسۇللا بۇ يەردە تەپسىلىي تونۇشتۇرۇلىدۇ.
2-ΔΔct ئۇسۇلى: ئېرىشكەن نەتىجە تەجرىبە گۇرۇپپىسىدىكى نىشان گېننىڭ كونترول گۇرۇپپىسىدىكى نىشان گېنى بىلەن ئىپادىلىنىشىدىكى پەرق.نىشان گېننىڭ ۋە ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمى% 100 كە يېقىنلىشىشى ، نىسپىي ئېغىش نىسبىتى% 5 تىن ئېشىپ كەتمەسلىكى تەلەپ قىلىنىدۇ.
ھېسابلاش ئۇسۇلى تۆۋەندىكىچە:
Controlct كونترول گۇرۇپپىسى = كونترول گۇرۇپپىسىدىكى نىشان گېننىڭ ct قىممىتى - كونترول گۇرۇپپىسىدىكى ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ ct قىممىتى
Δct تەجرىبە گۇرۇپپىسى = تەجرىبە گۇرۇپپىسىدىكى نىشان گېننىڭ ct قىممىتى - تەجرىبە گۇرۇپپىسىدىكى ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ ct قىممىتى
ΔΔct = Δct تەجرىبە گۇرۇپپىسى- Δct كونترول گۇرۇپپىسى
ئاخىرىدا ، ئىپادىلەش سەۋىيىسىدىكى كۆپ خىل پەرقنى ھېسابلاپ چىقىڭ:
Fold = 2-ΔΔct نى ئۆزگەرتىش (مۇنەۋۋەر ئىقتىدارغا ماس كېلىدىغان POWER)
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:
يوللانغان ۋاقتى: 5-ئايدىن 2023-يىلغىچە
