• PCR ئاز مىقداردىكى DNA قېلىپىدىن DNA نى كېڭەيتىشتە قوللىنىلىدىغان ئۇسۇل.RT-PCR تەتۈر ترانسكرىپسىيە ئارقىلىق RNA مەنبەسىدىن DNA قېلىپىنى ھاسىل قىلىدۇ ، ئاندىن ئۇنى كۈچەيتكىلى بولىدۇ.
• PCR ۋە RT-PCR ئادەتتە ئاخىرقى ئىنكاسلار ، qPCR ۋە RT-qPCR بولسا PCR ئىنكاسى جەريانىدا مەھسۇلات بىرىكتۈرۈش نىسبىتىنىڭ ھەرىكەت ئۇسۇلىنى ئىشلىتىپ ، قېلىپنىڭ مىقدارىنى مىقدارلاشتۇرىدۇ.
• رەقەملىك PCR قاتارلىق يېڭى ئۇسۇللار دەسلەپكى DNA قېلىپىنى مۇتلەق مىقدار بىلەن تەمىنلەيدۇ ، ئىسسىقلىق PCR قاتارلىق ئۇسۇللار قىممەت باھالىق ئۈسكۈنىلەرنىڭ ئىشەنچلىك نەتىجىنى تەمىنلەش ئېھتىياجىنى تۆۋەنلىتىدۇ.

پولىمېرازا زەنجىرسىمان ئىنكاسى (PCR) بىر قەدەر ئاددىي ۋە كەڭ قوللىنىلغان مولېكۇلا بىئولوگىيە تېخنىكىسى بولۇپ ، DNA ۋە RNA تەرتىپىنى كۈچەيتىدۇ ۋە بايقىيالايدۇ.DNA نى كلونلاش ۋە كۈچەيتىشنىڭ ئەنئەنىۋى ئۇسۇللىرىغا سېلىشتۇرغاندا ، PCR غا پەقەت بىر نەچچە سائەتلا ۋاقىت كېتىدۇ.PCR ئىنتايىن سەزگۈر بولۇپ ، كونكرېت تەرتىپلەرنى بايقاش ۋە كۈچەيتىش ئۈچۈن ئەڭ تۆۋەن قېلىپنى تەلەپ قىلىدۇ.PCR نىڭ ئاساسى ئۇسۇللىرى ئاددىي DNA ۋە RNA بايقاشتىن تېخىمۇ ئىلگىرىلىدى.تۆۋەندە بىز ئوخشىمىغان PCR ئۇسۇللىرى ۋە Enzo ھاياتلىق ئىلمى تەتقىقاتى بىلەن تەمىنلەيدىغان رېئاكتورلار ھەققىدە ئومۇمىي چۈشەنچە بەردۇق.بىز ئالىملارنىڭ كېيىنكى تەتقىقات تۈرىدە ئىشلىتىش ئۈچۈن PCR رېئاكتورىغا تېزرەك ئېرىشىشىگە ياردەم قىلىشنى مەقسەت قىلىمىز!

PCR

ئۆلچەملىك PCR ئۈچۈن ، سىز ئېھتىياجلىق بولغىنى DNA پولىمېراسى ، ماگنىي ، يادرو ، پىرىمېر ، كۈچەيتىلىدىغان DNA قېلىپى ۋە ئىسسىقلىق ساقلاش ماشىنىسى.PCR مېخانىزىمى ئۇنىڭ مەقسىتىگە ئوخشاش ئاددىي: 1) قوش لىنىيىلىك DNA (dsDNA) ئىسسىقلىق بىلەن ئىپادىلىنىدۇ ، 2) پىرىمېرلار يەككە DNA بەلبېغىغا ماسلىشىدۇ ، 3) دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ DNA پولىمېراسى ئارقىلىق ئۇزارتىلىدۇ ، نەتىجىدە ئىككى نۇسخا ئەسلى DNA.بىر قاتار تېمپېراتۇرا ۋە دەۋرنىڭ ئۆزگىرىشى ، ئۇلىنىشى ۋە ئۇزىراپ كېتىش جەريانى بىر قېتىملىق كۈچەيتىش دەۋرى دەپ ئاتالغان (1-رەسىم).

دەۋرىيلىكنىڭ ھەر بىر قەدىمىنى ئىشلىتىدىغان قېلىپ ۋە دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ ئۈچۈن ئەلالاشتۇرۇش كېرەك.بۇ دەۋرىيلىك تەخمىنەن 20-40 قېتىم تەكرارلىنىدۇ ، كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنى ئانالىز قىلىشقا بولىدۇ ، ئادەتتە ئاگاروزا گېلى (2-رەسىم).

PCR ئىنتايىن سەزگۈر ئۇسۇل بولغاچقا ، يەككە رېئاكسىيە ئۈچۈن ئىنتايىن كىچىك ھەجىم تەلەپ قىلىنغاچقا ، بىر نەچچە ئىنكاسقا ئۇستا ئارىلاشما تەييارلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.ئۇستا ئارىلاشتۇرۇشنى چوقۇم ياخشى ئارىلاشتۇرۇپ ، ئاندىن ئىنكاس سانىغا بۆلۈپ ، ھەر بىر ئىنكاسنىڭ ئوخشاش مىقداردىكى ئېنزىم ، DNTP ۋە پىرىمېر بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىش كېرەك.Enzo ھاياتلىق ئىلمى قاتارلىق نۇرغۇن تەمىنلىگۈچىلەرمۇ PCR ئارىلاشمىسى بىلەن تەمىنلەيدۇ ، بۇنىڭدا پىرىمېر ۋە DNA قېلىپىدىن باشقا ھەممە نەرسە بار.

گۋان / سىتوسىن مول (GC مول) رايونلار ئۆلچەملىك PCR تېخنىكىسىدىكى رىقابەتكە ۋەكىللىك قىلىدۇ.GC مول تەرتىپلىرى GC مەزمۇنى تۆۋەن بولغان تەرتىپلەرگە قارىغاندا تېخىمۇ مۇقىم.ئۇندىن باشقا ، GC مول تەرتىپلىك چاچ پاسونىغا ئوخشاش ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلارنى شەكىللەندۈرىدۇ.نەتىجىدە ، GC مول بولغان قوش سىزىقنى ئايرىش باسقۇچىدا پۈتۈنلەي ئايرىش تەس.نەتىجىدە ، DNA پولىمېراسى توسالغۇسىز يېڭى بەلۋاغنى بىرىكتۈرەلمەيدۇ.تېخىمۇ يۇقىرى ئايرىش تېمپېراتۇرىسى بۇنى ياخشىلايدۇ ، ھەمدە تېخىمۇ يۇقىرى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ۋە قىسقا ۋاقىت ئۇلاش ۋاقتىغا قاراپ تەڭشەش GC مول بولغان پىرىمېرلارنىڭ ئېنىق باغلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.قوشۇمچە رېئاكتور GC مول بولغان تەرتىپلەرنىڭ كۈچەيتىلىشىنى كۈچەيتەلەيدۇ.DMSO ، گلىتسېرىن ۋە بىتايىن GC نىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشىدىن كېلىپ چىققان ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلارنى قالايمىقانلاشتۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ ۋە بۇ ئارقىلىق قوش سىزىقنىڭ ئايرىلىشىنى ئاسانلاشتۇرىدۇ.

Hot Start PCR

ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىش PCR مەزگىلىدە يۈز بېرىدىغان مەسىلە.PCR ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان كۆپىنچە DNA پولىمېراسى 68 سېلسىيە گرادۇستىن 72 سېلسىيە گرادۇس ئەتراپىدا بولىدۇ.فېرمېنت گەرچە تۆۋەنرەك بولسىمۇ ، تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ئاكتىپ بولىدۇ.تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىدىن خېلىلا تۆۋەن تېمپېراتۇرىدا ، پىرىمېرلار مۇز ئۈستىدە ئورنىتىلغان تەقدىردىمۇ ، ئالاھىدە باغلانماي ، ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.مەلۇم تېمپېراتۇرىغا يەتكەندىن كېيىن ئاندىن DNA پولىمېراسىدىن ئايرىلىدىغان پولىمېرازا چەكلىگۈچنى ئىشلىتىش ئارقىلىق بۇنىڭ ئالدىنى ئالغىلى بولىدۇ ، شۇڭلاشقا ئىسسىق باشلىنىش PCR دېگەن سۆز.ئىنگىبىتور ئانتىتېلا بولۇپ ، دەسلەپكى ئايلىنىش تېمپېراتۇرىسىدا (ئادەتتە ° C 95) پولىمېرازا ۋە دانىخورەكنى باغلايدۇ.

يۇقىرى سادىقلىق پولىمېراسى

DNA پولىمېراسى ئەسلى قېلىپ تەرتىپىگە بىر قەدەر توغرا كۈچەيتىلگەن بىلەن ، يادرونىڭ ماسلىشىشىدا خاتالىق كۆرۈلىدۇ.كلونلاش قاتارلىق قوللىنىشچان پروگراممىلاردىكى ماسلاشماسلىق خاتىرىسىنى قىسقارتىپ ، تۆۋەنكى ئېقىندا ئۆز-ئارا ماسلاشمىغان ياكى ئاكتىپ بولمىغان ئاقسىلنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.بۇ ماسلاشماسلىقتىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، «كوررېكتورلۇق» پائالىيىتى بىلەن پولىمېرازا ئېنىقلىنىپ ، خىزمەت ئېقىمىغا بىرلەشتۈرۈلدى.تۇنجى كوررېكتورلۇق پولىمېرازا Pfu 1991-يىلى Pyrococcus furiosus دا ئېنىقلانغان.بۇ Pfu ئېنزىمنىڭ 3 دىن 5 كىچە بولغان ئېكولوگىيىلىك پائالىيىتى بار.DNA نىڭ كۈچىيىشىگە ئەگىشىپ ، exonuclease بەلۋاغنىڭ 3 'ئۇچىدىكى ماسلاشمىغان يادرونى يوقىتىدۇ.ئاندىن توغرا يادرونىڭ ئورنىنى ئالىدۇ ۋە DNA بىرىكتۈرۈش داۋاملىشىدۇ.توغرا بولمىغان يادرونىڭ تەرتىپلىرىنى پەرقلەندۈرۈش فېرمېنت بىلەن توغرا بولغان يادرو يادروسى ترىفوسفاتنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى ئاساس قىلىدۇ ، بۇ يەردە ئۈنۈمسىز باغلىنىش بىرىكتۈرۈشنى ئاستىلىتىدۇ ھەمدە توغرا ئالماشتۇرۇشقا بولىدۇ.Pfu پولىمېرازانىڭ كوررېكتورلۇق پائالىيىتى تاك DNA پولىمېراسىغا سېلىشتۇرغاندا ئاخىرقى تەرتىپتە ئازراق خاتالىق كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.يېقىنقى يىللاردىن بۇيان ، باشقا كوررېكتورلۇق ئېنزىملار ئېنىقلاندى ، ئەسلىدىكى Pfu ئېنزىمغا ئۆزگەرتىش كىرگۈزۈلۈپ ، DNA كېڭەيتىش جەريانىدا خاتالىق نىسبىتى تېخىمۇ تۆۋەنلىدى.

RT-PCR

تەتۈر كۆچۈرۈلگەن PCR ياكى RT-PCR RNA نى قېلىپ قىلىپ ئىشلىتىشكە يول قويىدۇ.قوشۇمچە قەدەم RNA نى بايقاش ۋە كېڭەيتىشكە يول قويىدۇ.RNA تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن ، تولۇقلانغان DNA (cDNA) غا تەتۈر كۆچۈرۈلگەن.RT-PCR نىڭ مۇۋەپپەقىيىتى ئۈچۈن RNA قېلىپىنىڭ سۈپىتى ۋە ساپلىقى ئىنتايىن مۇھىم.RT-PCR نىڭ بىرىنچى قەدىمى DNA / RNA ئارىلاش ماتورلۇق بىرىكتۈرۈش.تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىدا يەنە RNase H ئىقتىدارى بار ، ئۇ ئارىلاش ماتورلۇق RNA قىسمىنى تۆۋەنلىتىدۇ.ئاندىن تاق يۆنىلىشلىك DNA مولېكۇلاسى CDNA غا تەتۈر كۆچۈرۈلگەن DNA غا تايىنىدىغان DNA پولىمېرا پائالىيىتى ئارقىلىق تاماملىنىدۇ.بىرىنچى رەتتىكى ئىنكاسنىڭ ئۈنۈمى كۈچەيتىش جەريانىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ.بۇ يەردىن باشلاپ ، ئۆلچەملىك PCR تەرتىپى cDNA نى كېڭەيتىشكە ئىشلىتىلىدۇ.RT-PCR تەرىپىدىن RNA نى cDNA غا ئايلاندۇرۇشنىڭ نۇرغۇن ئەۋزەللىكى بار ، ئۇ ئاساسلىقى گېن ئىپادىلەش ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.RNA تاق يۆنىلىشلىك ۋە ئىنتايىن تۇراقسىز بولۇپ ، ئىشلەشنى قىيىنلاشتۇرۇۋېتىدۇ.ئۇ ئادەتتە qPCR نىڭ بىرىنچى قەدىمى بولۇپ ، بىئولوگىيىلىك ئەۋرىشكە RNA خاتىرىسىنى مىقدارلاشتۇرىدۇ.

qPCR ۋە RT-qPCR

مىقدار PCR (qPCR) نۇرغۇنلىغان قوللىنىشچان پروگراممىلارنىڭ يادرو كىسلاتاسىنى بايقاش ، خاراكتېرلەندۈرۈش ۋە مىقدارلاشتۇرۇشتا ئىشلىتىلىدۇ.RT-qPCR دا ، RNA خاتىرىسىنى ھەمىشە يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك ئالدى بىلەن cDNA غا يۆتكەش ئارقىلىق مىقدارلاشتۇرۇلىدۇ ، ئاندىن qPCR كېيىن ئېلىپ بېرىلىدۇ.ئۆلچەملىك PCR غا ئوخشاش ، DNA ئۈچ خىل تەكرارلاش باسقۇچى ئارقىلىق كۈچەيتىلىدۇ: ئايرىش ، ئۇلاش ۋە ئۇزارتىش.قانداقلا بولمىسۇن ، qPCR دا ، فلۇئورېسسېنسىيە بەلگىسى PCR نىڭ تەرەققىياتىغا ئەگىشىپ سانلىق مەلۇمات توپلاشقا ياردەم بېرىدۇ.بۇ تېخنىكىنىڭ بار بولغان ئۇسۇل ۋە خىمىيىلىك ماددىلارنىڭ دائىرىسى سەۋەبىدىن نۇرغۇن پايدىسى بار.

بوياقنى ئاساس قىلغان qPCR (ئادەتتە يېشىل) ، فلۇئورېسسېنسىيە بەلگىسى dsDNA باغلاش بوياق ئىشلىتىش ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن DNA مولېكۇلاسىنى مىقدارلاشتۇرالايدۇ.ھەر بىر ئايلىنىش جەريانىدا فلۇئورېسسېنسىيە ئۆلچەم قىلىنىدۇ.فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى كۆپەيتىلگەن DNA مىقدارىغا ماس ھالدا ئاشىدۇ.شۇڭلاشقا ، DNA «ھەقىقىي ۋاقىت» تا مىقدارلاشقان (3-رەسىم).بوياشنى ئاساس قىلغان qPCR نىڭ كەمچىلىكى شۇكى ، بىرلا ۋاقىتتا پەقەت بىرلا نىشاننى تەكشۈرگىلى بولىدۇ ھەمدە بوياق ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى ھەر قانداق ds-DNA بىلەن باغلىنىدۇ.

تەكشۈرۈشنى ئاساس قىلغان qPCR دا ، ھەر بىر ئەۋرىشكىدە بىرلا ۋاقىتتا نۇرغۇن نىشانلارنى بىرلا ۋاقىتتا بايقىغىلى بولىدۇ ، ئەمما بۇنىڭدا پىرىمېردىن باشقا ئىشلىتىلىدىغان نىشانلىق تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئەلالاشتۇرۇش ۋە لايىھىلەشكە توغرا كېلىدۇ.بىر نەچچە خىل تەكشۈرۈش ئەسۋابى بار ، ئەمما ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان تىپ فتوروفور ۋە ئۆچۈرگۈچنى ئۆز ئىچىگە ئالغان گىدرولىز تەكشۈرۈش ئەسۋابى.فلۇئورېسسېنسېن رېزونانىس ئېنېرگىيىسىنىڭ يۆتكىلىشى (FRET) تەكشۈرۈش ئەسۋابى مۇكەممەل ھالەتتە فتوروفورنىڭ ئۆڭكۈر ئارقىلىق قويۇپ بېرىلىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، PCR ئىنكاسى جەريانىدا ، ئۇ چەكلەنگەن كونكېرت تەرتىپنى كېڭەيتىش ۋە كېڭەيتىش جەريانىدا تەكشۈرۈش ئەسۋابى ھىدرولىزلىنىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ يېرىلىشى فتوروفورنى ئۆڭكۈردىن ئايرىپ ، فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ كۈچىيىشىگە تايىنىپ كۆپىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (4-رەسىم).شۇڭا ، تەكشۈرۈشنى ئاساس قىلغان qPCR ئىنكاسىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى تەكشۈرۈش نىشانىنىڭ مىقدارىغا ماس كېلىدۇ.تەكشۈرۈشنى ئاساس قىلغان qPCR بوياقنى ئاساس قىلغان qPCR غا قارىغاندا تېخىمۇ ئېنىق بولغاچقا ، ئۇ دائىم qPCR نى ئاساس قىلغان دىئاگنوز قويۇشتا قوللىنىلىدىغان تېخنىكا.

Isothermal Amplification

PCR يۇقىرىدا تىلغا ئېلىنغان تېخنىكىلار قىممەت باھالىق ئىسسىقلىق تارقىتىش ئۈسكۈنىلىرىنى تەلەپ قىلىدۇ ، ئايرىش ، ياندۇرۇش ۋە كېڭەيتىش باسقۇچلىرى ئۈچۈن كامېرنىڭ تېمپېراتۇرىسىنى توغرا ئۆرلىتىدۇ.بۇنداق ئېنىق ئۈسكۈنىلەرگە ئېھتىياجلىق بولمىغان بىر قاتار تېخنىكىلار بارلىققا كەلگەن بولۇپ ، ئاددىي سۇ مۇنچىسىدا ھەتتا قىزىقىش ھۈجەيرىلىرى ئىچىدە ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.بۇ تېخنىكىلار كوللىكتىپ ھالدا ئىسسىقلىقنى كۈچەيتىش دەپ ئاتىلىدۇ ۋە كۆرسەتكۈچ ، سىزىقلىق ياكى كاساتلاش كۈچەيتىشنى ئاساس قىلىدۇ.

ھەممىگە تونۇشلۇق بولغان ئىسسىقلىق تارقىتىش كۈچەيتمىسى ئايلانما ۋاسىتىلىك ئىسسىقلىق كۈچەيتكۈچ ياكى LAMP.LAMP قېلىپنىڭ DNA ياكى RNA نى كۈچەيتىش ئۈچۈن 65⁰C دە كۆرسەتكۈچ كۈچەيتكۈچ ئىشلىتىدۇ.LAMP نى ئىجرا قىلغاندا ، نىشان DNA نىڭ رايونلىرىنى تولۇقلايدىغان تۆتتىن ئالتەكىچە بولغان دەسلەپكى DNA DNA پولىمېراسى ئارقىلىق يېڭى DNA نى بىرىكتۈرۈشكە ئىشلىتىلىدۇ.بۇ پىرىمېرلارنىڭ ئىككىسى باشقا پىرىمېرلارنىڭ تەرتىپىنى تونۇيدىغان ۋە ئۇلارنى باغلايدىغان ماختاش تەرتىپىگە ئىگە بولۇپ ، يېڭى بىرىكتۈرۈلگەن DNA دا «ئايلانما» قۇرۇلمىنىڭ شەكىللىنىشىگە شارائىت ھازىرلاپ ، كېيىنكى باسقۇچتىكى كۈچەيتكۈچلەردە دەسلەپكى قەدەمدە تۇتاشتۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ.لامپۇچكىنى فلۇئورېسسېنسىيە ، ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى ياكى رەڭگى قاتارلىق كۆپ خىل ئۇسۇللار ئارقىلىق تەسۋىرلىگىلى بولىدۇ.رەڭلىك رەڭ ئارقىلىق مەھسۇلاتنىڭ بار-يوقلۇقىنى تەسۋىرلەش ۋە بايقاشنىڭ ئاسانلىقى ۋە تەلەپ قىلىنغان قىممەت باھالىق ئۈسكۈنىلەرنىڭ كەملىكى LAMP نى كلىنىكىلىق تەجرىبىخانا تەكشۈرۈشى ئاسان بولمىغان رايونلاردا ياكى ئەۋرىشكە ساقلاش ۋە توشۇشتا SARS-CoV-2 سىنىقىنىڭ مۇۋاپىق تاللىشىغا ئايلاندۇردى. مۇمكىن ئەمەس ، ياكى تەجرىبىخانىلاردا ئىلگىرى PCR ئىسسىقلىق ساقلاش ئۈسكۈنىسى يوق.