1. دەسلەپكى چۈشىنىش
بۇ باسقۇچتا بىز بەزى ئۇقۇم ۋە ئاتالغۇلارنى چۈشىنىشىمىز كېرەك ، بۇنداق بولغاندا ياشانغانلىرىمىزنىڭ ئالدىدا خاتالىق سادىر قىلىشتىن ساقلىنىشىمىز كېرەك ، مەسىلەن:
مۇخبىر: RT-PCR ، qPCR ، ھەقىقىي PCR ۋە ھەقىقىي RT-PCR نىڭ قانداق پەرقى بار؟
جاۋاب: RT-PCR تەتۈر كۆچۈرۈلگەن PCR(تەتۈر ترانسكرىپسىيە PCR ، RT-PCR) ، ئۇ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان پولىمېرازا زەنجىرسىمان ئىنكاسى (PCR).RT-PCR دە ، RNA بەلبېغى تەتۈر تولۇقلانغان DNA غا كۆچۈرۈلۈپ ، PCR تەرىپىدىن DNA كېڭەيتىشنىڭ قېلىپى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.
ھەقىقىي ۋاقىت- PCR ۋە qPCR(مىقدار Rea-ltime-PCR) ئوخشاش نەرسە ، ھەر ئىككىسى ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR ، يەنى PCR نىڭ ھەر بىر دەۋرىيلىكىنىڭ ھەقىقىي سانلىق مەلۇمات خاتىرىسى بارلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ ، شۇڭا قېلىپلارنىڭ سانىنى ئېنىق تەھلىل قىلىشقا بولىدۇ.
گەرچە ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR (ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR) ۋە تەتۈر ترانسكرىپسىيە PCR (تەتۈر ترانسكرىپسىيە PCR) ھەر ئىككىلىسى RT-PCR دەپ قىسقارتىلغاندەك قىلسىمۇ ، ئەمما خەلقئارالىق ئەھدىنامە: RT-PCR تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى كۆرسىتىدۇ.PCR ، Real-PCR ئادەتتە قىسقارتىلىپ qPCR (مىقدارلاشقان ھەقىقىي ۋاقىت PCR) دەپ ئاتىلىدۇ..
ھەقىقىي ۋاقىتتىكى RT-PCR (RT-qPCR) ، ئۇ فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار تېخنىكىسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن تەتۈر كۆچۈرۈلگەن PCR.: ئالدى بىلەن RNA تەتۈر كۆچۈرۈلۈشىدىن cDNA (RT) غا ئېرىشىڭ ، ئاندىن مىقدار ئانالىزى (qPCR) ئۈچۈن ھەقىقىي ۋاقىت PCR نى ئىشلىتىڭ.كۆپىنچە تەجرىبىخانىلار RT-qPCR ، يەنى RNA ئىپادىسىنى تۆۋەنلىتىش تەتقىقاتى بىلەن شۇغۇللىنىدۇ ، شۇڭا تەجرىبىخانىدا كۆپچىلىك سۆزلەيدىغان qPCR ئەمەلىيەتتە RT-qPCR نى كۆرسىتىدۇ ، ئەمما كلىنىكىلىق قوللىنىشتا يەنىلا نۇرغۇن DNA تەكشۈرۈشىنىڭ بارلىقىنى ئۇنتۇپ قالماڭ.مىقدار ئانالىزى ، مەسىلەن B تىپلىق جىگەر ياللۇغى ۋىرۇسى HBV بايقاش.
سوئال: فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR نى كۆپ ئوقۇغاندىن كېيىن ، نېمىشقا كۈچەيتىلگەن بۆلەكنى 80-300bp ئارىلىقىدا كونترول قىلىش كېرەك؟
جاۋاب.مەھسۇلات پارچىسى بەك قىسقا بولۇپ ، دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقىدىن پەرقلەنمەيدۇ.پىرىزدېنتنىڭ ئۇزۇنلۇقى تەخمىنەن 30-40bp ئەتراپىدا بولۇپ ، ئەگەر 80bp دىن تۆۋەن بولسا ، ئۇ پىرىمېر ياكى دىئامېتر ئىكەنلىكىنى پەرقلەندۈرۈش تەس.ئەگەر مەھسۇلات پارچىسى بەك ئۇزۇن بولۇپ ، 300bp دىن ئېشىپ كەتسە ، ئاسانلا تۆۋەن دەرىجىدىكى كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ۋە گېننىڭ مىقدارىنى ئۈنۈملۈك بايقىيالمايدۇ.
مەسىلەن ، بىر سىنىپتا قانچە ئادەم بارلىقىنى ھېسابلىغاندا ، پەقەت قانچىلىك ئېغىز بارلىقىنى ساناپ بېقىشىڭىز كېرەك.گېننى بايقىغىنىڭىزدا ئوخشاش ، سىز پەقەت گېننىڭ مەلۇم تەرتىپىنى بايقىشىڭىز كېرەك ، پۈتكۈل تەرتىپكە ۋەكىللىك قىلىدۇ.ئەگەر كىشىلەرنى ساناپ باقماقچى بولسىڭىز ، ئېغىز ۋە بۇرۇن ، قۇلاق ۋە كۆزئەينەكنى ساناپ بېقىشىڭىز كېرەك ، خاتالىق سادىر قىلىش ئاسان.
كېڭەيتىش ئۈچۈن ، بىئولوگىيىلىك تەتقىقاتتا ، نۇقتىدىن رايونغا قەدەر نۇرغۇن تەتقىقات ئەھۋاللىرى بار ، چۈنكى ھەر قانداق بىر جانلىقنىڭ گېن تەرتىپى ناھايىتى ئۇزۇن بولغاچقا ، باكتېرىيە 16S تەرتىپى قاتارلىق بارلىق پارچىلارنى ئۆلچەش ھاجەتسىز ۋە مۇمكىن ئەمەس ، بۇ باكتېرىيەنىڭ مۇتەئەسسىپ تەرتىپىنى قانات يايدۇرۇپ ، مەلۇم ساندىكى باكتېرىيە سانىنى يەكۈنلەيدۇ.
مۇخبىر: qPCR دەسلەپكى لايىھىلەشنىڭ ئەڭ ياخشى ئۇزۇنلۇقى نېمە؟
جاۋاب: ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى 20-24bp ئەتراپىدا ، بۇ تېخىمۇ ياخشى.ئەلۋەتتە ، بىز پىرىزما لايىھىلىگەندە چوقۇم دەسلەپكى قىممەتنىڭ TM قىممىتىگە دىققەت قىلىشىمىز كېرەك ، چۈنكى بۇ ئەڭ ياخشى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك.نۇرغۇن سىناقلاردىن كېيىن ، ° C60 نىڭ تېخىمۇ ياخشى TM قىممىتى ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى.ئەگەر تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بەك تۆۋەن بولسا ، ئاسانلا ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئەگەر تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بەك يۇقىرى بولسا ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى بىر قەدەر تۆۋەن بولىدۇ ، كۈچەيتمە ئەگرى سىزىقنىڭ چوققىسى كېيىن باشلىنىدۇ ، CT قىممىتى كېچىكىدۇ.
مۇخبىر: بوياش ئۇسۇلى تەكشۈرۈش ئۇسۇلى بىلەن قانداق پەرقى بار؟
جاۋاب: بوياش ئۇسۇلىSYBR Green Ⅰ ، PicoGreen ، BEBO قاتارلىق بىر قىسىم فلۇئورېسسېنسىيە بوياقلىرى ئۆزلۈكىدىن نۇر چىقارمايدۇ ، ئەمما قوش لىنىيىلىك DNA نىڭ كىچىك ئۆستەڭگە باغلانغاندىن كېيىن فلۇئورېسسېنسىيە تارقىتىدۇ.شۇڭلاشقا ، PCR ئىنكاسىنىڭ بېشىدا ، ماشىنا فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى بايقىيالمايدۇ.رېئاكسىيە ئۇلىنىش كېڭەيتىش باسقۇچىغا كەلگەندە ، قوش سىزىق ئېچىلىپ ، DNA پولىمېرازانىڭ ھەرىكىتىدە يېڭى بىر بەلۋاغ بىرىكتۈرۈلۈپ ، فلۇئورېسسېن مولېكۇلاسى dsDNA كىچىك ئۆستەڭگە تۇتىشىدۇ.PCR دەۋرىيلىكىنىڭ كۆپىيىشىگە ئەگىشىپ ، تېخىمۇ كۆپ بوياقلار قوش لىنىيىلىك DNA بىلەن بىرىكىدۇ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىمۇ ئۈزلۈكسىز كۈچىيىدۇ.بوياش ئۇسۇلى ئاساسلىقى ئىلمىي تەتقىقاتتا ئىشلىتىلىدۇ.
PS: تەجرىبە قىلغاندا ئېھتىيات قىلىڭ ، بوياقنى ئىنسانلارنىڭ DNA سى بىلەن بىرلەشتۈرۈش كېرەك ، ئۇنى فلۇئورېسسېنسىيىلىك ئادەمگە ئايلاندۇرۇشتىن ئېھتىيات قىلىڭ.
بوياش ئۇسۇلى (سولدا) تەكشۈرۈش ئۇسۇلى (ئوڭدا)
PS: تەجرىبە قىلغاندا ئېھتىيات قىلىڭ ، بوياقنى ئىنسانلارنىڭ DNA سى بىلەن بىرلەشتۈرۈش كېرەك ، ئۇنى فلۇئورېسسېنسىيىلىك ئادەمگە ئايلاندۇرۇشتىن ئېھتىيات قىلىڭ.
SYBR Green DNA DNA نىڭ كىچىك ئېغىزىغا تۇتىشىدۇ
تەكشۈرۈش ئۇسۇلىتاقمان تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان گىدرولىز تەكشۈرۈش ئەسۋابى.تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ 5 ′ ئۇچىدا فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى بار ، ئادەتتە FAM ، تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ ئۆزى نىشان گېننى تولۇقلايدىغان تەرتىپ.3 ′ ئاخىرىدا فلۇئورېسسېنسىيە ئۆچۈرۈش گۇرۇپپىسى بار.فلۇئورېسسېنسىيە رېزونانىس ئېنېرگىيىسىنى يۆتكەش (Förster رېزونانىس ئېنېرگىيىسى يۆتكەش ، FRET) پرىنسىپىغا ئاساسەن ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى (ئىئانە قىلغۇچى فلۇئورېسسېنسىيە مولېكۇلاسى) ۋە ئۆچۈرگۈچى فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى (قوبۇل قىلغۇچى فلۇئورېسسېن مولېكۇلاسى) ھاياجانلانغاندا ، سپېكترا ئۆز-ئارا قاپلانغان ۋە ئارىلىق ئىنتايىن يېقىن بولغاندا (7-10nm) ، ئىئانە قىلغۇچى مولېكۇلانىڭ ھاياجانلىنىشى قوبۇل قىلغۇچى مولېكۇلانى قوزغىتالايدۇ.شۇڭلاشقا ، PCR ئىنكاسىنىڭ دەسلىپىدە ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى ھەقسىز ۋە سىستېمىدا مۇكەممەل بولغاندا ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسى فلۇئورېسسېنسىيە چىقارمايدۇ.ئۇلىغاندا ، قەغەز ۋە تەكشۈرۈش ئەسۋابى قېلىپقا باغلىنىدۇ.كېڭەيتىش باسقۇچىدا ، پولىمېرازا يېڭى زەنجىرنى ئۇدا بىرىكتۈردى.DNA پولىمېرازانىڭ 5′-3 ′ ئېكولوگىيىلىك پائالىيىتى بار.تەكشۈرۈش ئەسۋابىغا يەتكەندە ، DNA پولىمېراسى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى قېلىپتىن ھىدرولىزلايدۇ ، مۇخبىر فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسىنى ئۆچۈرگۈچى فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسىدىن ئايرىپ ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى تارقىتىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن قېلىپ ئوتتۇرىسىدا بىرمۇ-بىر مۇناسىۋەت بولغاچقا ، تەكشۈرۈشنىڭ توغرىلىقى ۋە سەزگۈرلۈكى جەھەتتە تەكشۈرۈش ئۇسۇلى بوياش ئۇسۇلىدىن ئەۋزەل.تەكشۈرۈش ئۇسۇلى ئاساسلىقى دىئاگنوز قويۇشتا ئىشلىتىلىدۇ.
مۇخبىر: مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇش دېگەن نېمە؟نىسپىي مىقدار دېگەن نېمە؟
جاۋاب: مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇش qPCR تەرىپىدىن تەكشۈرۈلىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرىنى ھېسابلاشنى كۆرسىتىدۇ ، مەسىلەن 1 مىللىمېتىر قاندا قانچىلىك HBV ۋىرۇسى بار.نىسپىي مىقدار ئارقىلىق ئېرىشىلگەن نەتىجە باشقا بىر ئەۋرىشكە بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، مەلۇم ئەۋرىشكىدىكى نىشانلىق گېننىڭ مىقدارىنىڭ ئۆزگىرىشى بولۇپ ، گېننىڭ ئىپادىلىنىشى تەڭشەلگەن ياكى تۆۋەنگە تەڭشەلگەن.
مۇخبىر: RNA ئېلىش مىقدارى ، تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمى ۋە كۈچەيتىش ئۈنۈمى تەجرىبە نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتەمدۇ؟
مۇخبىر: ئەۋرىشكە ساقلاش ، ئېلىش رېئاكتورى ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەن رېئاكتور ۋە نۇر تارقىتىدىغان ئىستېمال بۇيۇملىرى تەجرىبە نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتەمدۇ؟
مۇخبىر: قايسى ئۇسۇل تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىنى توغرىلىيالايدۇ؟
بۇ مەسىلىلەرگە كەلسەك ، ئۇلارنى تۆۋەندىكى ئىلغار ۋە ئىلغار بۆلەكلەردە تەپسىلىي بايان قىلىمىز.
2. ئىلغار بىلىملەر
ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR غا كەلسەك ، بىز چوقۇم ھەر يىلى نەچچە مىڭلىغان ئىلمىي تەتقىقات ماقالىسىنىڭ ئېلان قىلىنىدىغانلىقىنى تونۇپ يېتىشىمىز كېرەك ، بۇنىڭ ئىچىدە فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR تېخنىكىسى ئاز ئەمەس.
ئەگەر فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR تەجرىبىسىنى ئۆلچەيدىغان ئورتاق ئۆلچەم بولمىسا ، نەتىجىسى ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.ئوخشاش تۈردىكى ئوخشاش گېنغا ، ئوخشاش بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇلى بىلەن ، بايقاش نەتىجىسىمۇ ئوخشىمايدۇ ، كېچىكىپ قالغانلارنىڭ ئوخشاش نەتىجىنى تەكرارلىشى تەسكە توختايدۇ.سىز قايسىسىنىڭ توغرا ، قايسىسىنىڭ خاتا ئىكەنلىكىنى ھېچكىم بىلمەيسىز.
بۇ فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR نىڭ ئالدامچىلىق تېخنىكىسى ياكى ئىشەنچسىز تېخنىكا ئىكەنلىكىدىن دېرەك بېرەمدۇ؟ياق ، ئۇ فلۇئورېسسېنسىيەلىك مىقدار PCR نىڭ تېخىمۇ سەزگۈر ۋە تېخىمۇ توغرا بولغانلىقى ئۈچۈن ، ئازراق خاتا مەشغۇلات پۈتۈنلەي قارمۇ قارشى نەتىجىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.كىچىككىنە زىيان مىڭ مىل يىراقلىقتا.ماقالىنىڭ ئاپتورى باھالىغۇچىلار تەرىپىدىن قايتا-قايتا قىيىن-قىستاققا ئېلىنىشى مۇمكىن.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، ژۇرنالنى باھالىغۇچىلارمۇ ئوخشىمىغان تەجرىبە نەتىجىسىنى تاللاش تەس.
ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، ھەقىقىي PCR تەجرىبىسىدە ئورتاق تونۇشنىڭ يوقلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇنىڭ ئۈچۈن بۇ ساھەدىكى پېشقەدەم ئالىملار ئۆلچەم تۈزۈشكە باشلىدى ،تۆھپىكارلارنىڭ بۇ ئۆلچەمگە يېتىش ئۈچۈن ماقالىدىكى زۆرۈر تەجرىبە ۋە سانلىق مەلۇماتلارنى بىر تەرەپ قىلىش تەپسىلاتلىرى (زۆرۈر سانلىق مەلۇماتلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) بىلەن تەمىنلىشىنى تەلەپ قىلىدۇ.
باھالىغۇچىلار بۇ تەپسىلاتلارنى ئوقۇش ئارقىلىق سىناقنىڭ سۈپىتىگە ھۆكۈم قىلالايدۇ.كەلگۈسىدىكى ئوقۇرمەنلەرمۇ بۇنى ئىشلىتىپ تەجرىبىنى تەكرارلايدۇ ياكى تەجرىبىنى ياخشىلايدۇ.ئاندىن بۇ ئۇسۇلدا قولغا كەلتۈرۈلگەن تەجرىبە نەتىجىسى ئۇچۇرغا ، يۇقىرى سۈپەتلىك ۋە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
MIBBI (بىئولوگىيىلىك ۋە بىئولوگىيەلىك تەكشۈرۈشنىڭ ئەڭ تۆۋەن ئۇچۇرى -http: // www.mibbi.org) بارلىققا كەلدى.MIBBI تەجرىبە ئۆلچىمى بىلەن تەمىنلەيدىغان تۈر.ئۇ تەبىئەتتە نەشر قىلىنغان.بۇ تۈر بىز ھازىر مۇلاھىزە قىلماقچى بولغان ھۈجەيرە بىئولوگىيىسى ، Microarray ، qPCR قاتارلىق ھەر خىل بىئولوگىيىلىك تەجرىبىلەرنى مەقسەت قىلغان بولۇپ ، قوليازما يوللىغاندا ھەر خىل سىناقلار بىلەن تەمىنلەيدۇ.ئۇ ئۇچۇرلار ھەر ۋاقىت تەمىنلىنىشى كېرەك.
MIBBI تۈرىدە فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR غا مۇناسىۋەتلىك ئىككى ماقالە بار ، ئۇلار:
· RDML (ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR سانلىق مەلۇمات بەلگىسى تىلى) - ھەقىقىي مىقداردىكى PCR سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ قۇرۇلمىلىق تىلى ۋە دوكلات يېتەكچىسى.
· MIQE (مىقدارلاشقان ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR تەجرىبىسىنى ئېلان قىلىشنىڭ ئەڭ تۆۋەن ئۇچۇرى) - ھەقىقىي مىقداردىكى PCR تەجرىبىسى توغرىسىدىكى ماقالىلەرنى ئېلان قىلىدىغان ئەڭ تۆۋەن ئۇچۇر.
ئالدى بىلەن ، RDML ، تېرمىنولوگىيە ئۆلچىمى ھەققىدە سۆزلەيلى.
ئەگەر ھەممە ئىشتا ئۆلچەملىك ئېنىقلىما بولمىسا ، مۇنازىرىنى داۋاملاشتۇرۇش مۇمكىن ئەمەس ، شۇڭلاشقا ئىمتىھاندا ئاتالغۇلارنى چۈشەندۈرۈش ئىنتايىن مۇھىم.
فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR تەجرىبىسىدە ئىشلىتىلگەن ئاتالغۇلار تۆۋەندىكى مەزمۇنلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.QIAGEN بىز ئۈچۈن ئەڭ ياخشى خۇلاسە چىقاردى.تۆۋەندىكىلەرنىڭ ھەممىسى قۇرۇقمال .
كېڭەيتىش ئەگرى سىزىقى
كۈچەيتمە ئەگرى سىزىق PCR جەرياندا ياسالغان ئەگرى سىزىقنى كۆرسىتىدۇ ، دەۋرىيلىك سان ئابىدە دەپ ئاتىلىدۇ ، رېئاكسىيە جەريانىدا رېئال ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى.
ئېسىل كۈچەيتىش ئەگرى سىزىقى تۆۋەندىكىدەك ئالاھىدىلىكلەرگە ئىگە بولۇشى كېرەك: ئاساسىي سىزىق تەكشى ياكى سەل تۆۋەنلىگەن ، كۆرۈنەرلىك ئۆسۈش يۈزلىنىشى يوقئەگرى سىزىقنىڭ بۇرۇلۇش نۇقتىسى ئېنىق ، كۆرسەتكۈچ باسقۇچنىڭ يانتۇلۇق كۈچى كۈچەيتىش ئۈنۈمى بىلەن ماس كېلىدۇ.يانتۇلۇق قانچە چوڭ بولسا ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى شۇنچە يۇقىرى بولىدۇ.ئومۇمىي كۈچەيتىش ئەگرى سىزىقى پاراللېللىق ياخشى بولۇپ ، ھەر بىر نەيچىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىنىڭ ئوخشاش ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ.تۆۋەن قويۇقلۇقتىكى ئەۋرىشكىلەرنىڭ كېڭەيتىش ئەگرى سىزىقىنىڭ كۆرسەتكۈچ باسقۇچى ئېنىق.
Baseline (Baseline)
ئاساسىي سىزىق دەسلەپكى دەۋرىيلىكنىڭ شاۋقۇن دەرىجىسى، ئادەتتە 3-ۋە 15-دەۋرىيلىك ئارىلىقىدا ئۆلچىنىدۇ ، چۈنكى كۈچەيتمە مەھسۇلات كەلتۈرۈپ چىقارغان فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتىنىڭ ئۆسۈشىنى بۇ مەزگىلدە بايقىغىلى بولمايدۇ.ئاساسىي سىزىقنى ھېسابلاشتا ئىشلىتىلىدىغان دەۋرىيلىكنىڭ سانى ھەر خىل بولىدۇ ، ئەگەر يۇقىرى قېلىپ مىقدارى ئىشلىتىلسە ياكى نىشان گېنىنىڭ ئىپادىلىنىش دەرىجىسى يۇقىرى بولسا ، ئۇنى ئازايتىشقا توغرا كېلىدۇ.
ئاساسىي سىزىقنى تەڭشەش سىزىقلىق كۈچەيتمە ئەگرى سىزىقتىن فلۇئورېسسېنسىيە سانلىق مەلۇماتلىرىنى كۆرۈشنى تەلەپ قىلىدۇ.ئاساسىي سىزىق قىلىپ بېكىتىلگەن بولۇپ ، چوڭايتىش ئەگرى سىزىقىنىڭ ئۆسۈشى ئاساسىي دەۋرىيلىك يۇقىرى ساندىن كۆپ دەۋرىيلىك سان بىلەن باشلىنىدۇ.ھەر بىر نىشان تەرتىپى ئۈچۈن ئاساسىي سىزىقلارنى ئايرىم بەلگىلەش كېرەك.دەسلەپكى دەۋرىيلىكتە بايقالغان ئوتتۇرىچە فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتلاردا ئېرىشكەن فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتىدىن ئايرىلىشى كېرەك.ھەرخىل Real-Time PCR يۇمشاق دېتالىنىڭ ئەڭ يېڭى نەشرى يەككە ئەۋرىشكىلەرنىڭ ئاساسىي تەڭشىكىنى ئاپتوماتىك ئەلالاشتۇرىدۇ.
PCR كۈچەيتىش ئىنكاسىنىڭ دەسلەپكى بىر قانچە دەۋرىدە ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىدا ئانچە چوڭ ئۆزگىرىش بولمايدۇ.تۈز سىزىققا يېقىنلىشىش ئاساسىي سىزىق دەپ ئاتىلىدۇ ، ئەمما ئالدىنقى بىر قانچە دەۋرىيلىككە ئىنچىكىلىك بىلەن قارايدىغان بولساق ، ئاساسىي سىزىقنىڭ ئاستىدىكى رەسىمدە نېمە ئىش بولغانلىقىنى كۆرىمىز.
تەگلىك ئارقا كۆرۈنۈشنى كۆرسىتىدۇ
رېئاكسىيەدىكى ئېنىق بولمىغان فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى.مەسىلەن: ئۈنۈمسىز فلۇئورېسسېنسىيەنى ئۆچۈرۈشياكى SYBR يېشىل ئىشلىتىش سەۋەبىدىن كۆپ ساندىكى قوش لىنىيىلىك DNA قېلىپى.سىگنالنىڭ تەگلىك زاپچاسلىرى Real-Time PCR يۇمشاق دېتال ئالگورىزىم ئارقىلىق ماتېماتىكىلىق ھالدا ئۆچۈرۈلىدۇ.
مۇخبىر سىگنالى
مۇخبىر سىگنالى SYBR Green ھاسىل قىلغان فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى ياكى ھەقىقىي ۋاقىت PCR دەۋرىدە فلۇئورېسسېنسىيەلىك بەلگە قويۇلغان تەرتىپلىك تەكشۈرۈشنى كۆرسىتىدۇ.
نورماللاشتۇرۇلغان مۇخبىر سىگنالى (RN)
RN ھەر بىر دەۋرىيلىكتە ئۆلچەم قىلىنغان پاسسىپ پايدىلىنىش بوياقنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلىكى بىلەن بۆلۈنگەن مۇخبىر بوياقنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلىكىنى كۆرسىتىدۇ.
پاسسىپ پايدىلىنىش بوياق
بەزى ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR لاردا ،فلۇئورېسسېنسىيە بوياق ROX فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنى نورماللاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىچكى پايدىلىنىش ئورنىدا ئىشلىتىلىدۇ.قۇدۇقنىڭ توغرا بولماسلىقى ، قۇدۇقنىڭ ئورنى ۋە فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ تەۋرىنىشى سەۋەبىدىن ئۆزگىرىشلەرنى تۈزىتىدۇ.
فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسى (بوسۇغىسى)
تەگلىك قىممىتىدىن يۇقىرى قىلىپ تەڭشەلگەن ئەگرى سىزىقنىڭ ئېگىزلىك قىممىتىدىن كۆرۈنەرلىك تۆۋەن بولغان.ئۇ چوقۇم چوڭايتىش ئەگرى سىزىقىنىڭ سىزىقلىق رايونىدا ياتقان بولۇپ ، PCR بايقاشنىڭ سىزىقلىق دائىرىسىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ.بوسۇغىسىنى خاتىرىلەش كۈچەيتمە ئەگرى سىزىق شەكلىدە بەلگىلەش كېرەك ، بۇنداق بولغاندا PCR نىڭ سىزىقلىق باسقۇچىنى ئاسانلا پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ.ئەگەر ھەقىقىي ۋاقىت PCR دا كۆپ خىل نىشان گېنى بولسا ، چوقۇم ھەر بىر نىشاننىڭ بوسۇغىسىنى بەلگىلەش كېرەك.ئادەتتە PCR ئىنكاسىنىڭ ئالدىنقى 15 دەۋرىيلىكىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى فلۇئورېسسېنسىيە ئارقا سىگنالى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ ، فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسى PCR نىڭ ئالدىنقى 3 دىن 15 دەۋرىيلىكىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ 10 ھەسسىسىگە تەڭ كېلىدۇ ، فلۇئورېسسېنسىيە بوسۇغىسى PCR كېڭەيتىشنىڭ تېزلىنىش باسقۇچىدا بەلگىلىنىدۇ.ئادەتتە ، ھەر بىر ئەسۋابنىڭ ئىشلىتىشتىن بۇرۇن فلۇئورېسسېنسىيە چېكى بار.
دەۋرىيلىك بوسۇغىسى (CT) ياكى كېسىشىش نۇقتىسى (CP)
كۈچەيتمە ئەگرى سىزىقتىن ھالقىغان دەۋرىيلىك (يەنى فلۇئورېسسېنسىيەنى تەكشۈرۈش نۇقتىسى كۆرۈنەرلىك ئاشىدۇ).CT بىر بۆلەك بولۇپ ، باشلىنىش قېلىپىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.CT قىممىتى ھەر PCR رېئاكسىيە تۇرۇبىسىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالى بېكىتىلگەن چەككە يەتكەندە باشتىن كەچۈرگەن دەۋرىيلىك سانىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.ھەر بىر قېلىپنىڭ CT قىممىتى بىلەن قېلىپنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرىنىڭ لوگارىزىم ئوتتۇرىسىدا تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋەت باردەسلەپكى كۆپەيتىلگەن سان قانچە يۇقىرى بولسا ، CT قىممىتى شۇنچە كىچىك بولىدۇ.مەلۇم بولغان دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇر بىلەن ئۆلچەملىك ئىشلىتىش ئارقىلىق ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلغىلى بولىدۇ ، بۇنىڭدا abscissa CT قىممىتىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ، بۇيرۇق بولسا دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرنىڭ لوگارىزىمغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.شۇڭلاشقا ، نامەلۇم ئەۋرىشكىنىڭ CT قىممىتىگە ئېرىشسىلا ، ئەۋرىشكىنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرىنى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقتىن ھېسابلىغىلى بولىدۇ.
ΔCT قىممىتى
ΔCT قىممىتى تەسۋىرلىنىدۇنىشان گېنى بىلەن ماس كېلىدىغان ئىچكى گېن CT قىممىتىنىڭ پەرقىمەسىلەن ، ئائىلە ئاسراش گېنى ، ھەمدە ئىشلىتىلگەن قېلىپنىڭ مىقدارىنى نورماللاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ:
⇒ΔCT = CT (نىشانلىق گېن) - CT (ئىچكى مەنبەلىك گېن)
ΔΔCT قىممىتى
ΔΔCT قىممىتى قىزىقىش ئەۋرىشكىسىنىڭ ئوتتۇرىچە ΔΔCT قىممىتى (مەسىلەن غىدىقلانغان ھۈجەيرىلەر) بىلەن پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسىنىڭ ئوتتۇرىچە ΔΔCT قىممىتى ئوتتۇرىسىدىكى پەرقنى تەسۋىرلەيدۇ.پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسى يەنە تەقلىد قىلىش ئەۋرىشكىسى دەپمۇ ئاتىلىدۇ ، باشقا ئەۋرىشكەلەر بۇنىڭغا نىسپىي مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن نورماللاشتۇرۇلدى:
⇒ΔΔCT = ئوتتۇرىچە ΔCT (ئۆسۈم ئەۋرىشكىسى) - ئوتتۇرىچە ΔCT (پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسى)
ئىچكى مەنبەلىك گېن (ئىچكى مەنبەلىك گېن)
ئائىلە گېنى (ئائىلە ئاسراش گېنى) قاتارلىق ئىچكى مەنبەلىك گېننىڭ ئىپادىلىنىش دەرىجىسى ئەۋرىشكە بىلەن پەرقلەنمەيدۇ.پايدىلىنىش گېنىنىڭ CT قىممىتىنى نىشان گېنى بىلەن سېلىشتۇرۇش نىشان گېننىڭ ئىپادىلەش دەرىجىسىنى كىرگۈزگەن RNA ياكى cDNA مىقدارىغا نورماللاشتۇرالايدۇ (يۇقىرىدىكى ΔCT قىممىتى دېگەن بۆلەككە قاراڭ).
ئىچكى پايدىلىنىش گېنى توغراRNA ئەۋرىشكىسىدىكى RNA نىڭ بۇزۇلۇشى ياكى فېرمېنت چەكلىگۈچىنىڭ بولۇشى ، شۇنداقلا RNA مەزمۇنىنىڭ ئۆزگىرىشى ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى ، يادرو كىسلاتاسىنىڭ ئەسلىگە كېلىشى ۋە ئەۋرىشكە بىر تەرەپ قىلىش قاتارلىقلار.ئەڭ ياخشى پايدىلىنىش گېنى (لارنى) تاللاش ئۈچۈن ، ئالگورىزىمنى ئۆزگەرتىپ ، ئۇنىڭ تەجرىبە تەڭشىكىگە باغلىق بولغان ئەڭ ياخشى پايدىلىنىشنى تاللىشىغا يول قويدۇق.
ئىچكى كونترول
نىشان تەرتىپى بىلەن ئوخشاش ئىنكاستا كۈچەيتىلگەن ۋە ئوخشىمىغان تەكشۈرۈش ئەسۋابى (يەنى كۆپەيتىلگەن PCR ئىجرا قىلىش) بىلەن كونترول قىلىنىدىغان كونترول تەرتىپى.ئىچكى كونترول ھەمىشە مەغلۇپ بولغان كۈچەيتكۈچنى يوققا چىقىرىشقا ئىشلىتىلىدۇ ، مەسىلەن نىشان تەرتىپى بايقالمىغاندا.
Calibration Sample
پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسى (مەسىلەن ، RNA نى ھۈجەيرە سىزىقى ياكى توقۇلمىلاردىن ساپلاشتۇردى) نىسپىي مىقداردا ئىشلىتىپ ، باشقا ئەۋرىشكەلەرنى سېلىشتۇرۇپ ، گېننىڭ نىسپىي ئىپادىلەش دەرىجىسىنى بەلگىلىدى.تەقلىد قىلىش ئەۋرىشكىسى ھەر قانداق ئەۋرىشكە بولالايدۇ ، ئەمما ئادەتتە كونترول بولىدۇ (مەسىلەن ، بىر تەرەپ قىلىنمىغان ئەۋرىشكە ياكى تەجرىبە نۆلدىن كەلگەن ئەۋرىشكە).
ئاكتىپ كونترول
with control reaction withمەلۇم مىقداردىكى قېلىپ.ئاكتىپ كونترول قىلىش كۆپىنچە ۋاقىت جەدۋىلى ياكى دەسلەپكى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ نورمال ئىشلەۋاتقانلىقىنى ۋە ئىنكاسنىڭ توغرا تەڭشەلگەنلىكىنى تەكشۈرۈشكە ئىشلىتىلىدۇ.
قېلىپنى كونترول قىلىش يوق (NTC)
قېلىپتىن باشقا كۈچەيتمە رېئاكسىيەنىڭ بارلىق زۆرۈر تەركىبلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان كونترول ئىنكاسى ، ئادەتتە سۇ بىلەن ئالماشتۇرۇلىدۇ.NTC نى ئىشلىتىش رېئاكتىپ بۇلغىنىش ياكى چەتئەلنىڭ DNA سى كەلتۈرۈپ چىقارغان بۇلغىنىشنى تاپالايدۇ ، شۇڭا بايقاش سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ چىنلىقى ۋە ئىشەنچلىكلىكىگە كاپالەتلىك قىلىدۇ.NTC كونتروللۇقىنىڭ كۈچەيتىلىشى بۇلغىنىشنى كۆرسىتىدۇ.
RT كونتروللۇقى يوق (NRT)
RNA ئېلىش جەريانىدا قالدۇق گېن گۇرۇپپىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان بولۇشى مۇمكىن ، بۇ ئىنتايىن زىيانلىق بولۇپ ، سانلىق مەلۇمات سۈپىتىگە ۋە qPCR نىڭ تەبىئىي دۈشمىنىگە تەسىر يەتكۈزىدىغان جىنايەتچى ، شۇڭا تەجرىبە لايىھىلىگەندە ، چوقۇم RNA بايقاشنى كۈچەيتىش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن بولۇشى كېرەك.ئىككى خىل ئۇسۇل بار ، بىرى پىرىسنى ئىچكى قىسىمغا لايىھىلەش ، يەنە بىرى DNA نى پۈتۈنلەي ئېلىۋېتىش ، قايسىسى ياخشىراق ، كېيىن مۇلاھىزە قىلىنىدۇ.NTR كونتروللۇقى DNA نىڭ بۇلغىنىشىنى بايقاشتىكى سېھىرلىك ئەينەك.ئەگەر كۈچەيتىش بولسا ، بۇ بۇلغىنىشنىڭ بارلىقىنى بىلدۈرىدۇ.
ئۆلچەم
ئۆلچەم ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ياساشقا ئىشلىتىلىدىغان مەلۇم قويۇقلۇقى ياكى كۆپەيتىلگەن نومۇرنىڭ ئەۋرىشكىسى.ئۆلچەمنىڭ مۇقىملىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، گېن پارچىسى ئادەتتە پىلازما ئىچىگە كلونلىنىپ ، ئۆلچەم سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.
ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق
ئادەتتە ئىككى ھەسسە نىسبىتىگە ئاساسەن ئۆلچەملىك مەھسۇلات بىلەن كەم دېگەندە 5 قويۇقلۇق دەرىجىسىگە ئايرىلىدۇ ، CT قىممىتى ۋە كۆپەيتىلگەن ساننىڭ كوئوردېناتىدا 5 نومۇر سىزىلىدۇ ، بۇ نۇقتىلار بىر سىزىققا ئۇلىنىپ ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلىدۇ.ھەر بىر ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئۈچۈن ئۇنىڭ ئىناۋەتلىكلىكىنى تەكشۈرۈش كېرەك.يانتۇلۇقنىڭ قىممىتى –3.3 بىلەن -3.8 ئارىلىقىدا تۆۋەنلەيدۇ ، ھەر بىر قويۇقلۇقى ئۈچ ھەسسە ئېلىپ بېرىلىدۇ.باشقا نۇقتىلاردىن كۆرۈنەرلىك پەرقلىنىدىغان نۇقتىلارنى تاشلىۋېتىش كېرەك.سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ CT قىممىتى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىققا ئېلىپ كېلىنىدۇ ، سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ ئىپادىلىنىش دەرىجىسىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.
سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ CT قىممىتى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىققا ئېلىپ كېلىنىدۇ ، سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.
ئۈنۈم ۋە يانتۇلۇق
ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق يانتۇلۇق ھەقىقىي PCR نىڭ ئۈنۈمىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ.
· -3.322 يانتۇلۇق PCR نىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىنىڭ 1 ياكى 100% ئۈنۈملۈك ئىكەنلىكىنى ، PCR مەھسۇلات مىقدارىنىڭ ھەر بىر دەۋرىيلىكتە بىر قاتلىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
· 3.322 دىن تۆۋەن يانتۇلۇق (مەسىلەن ، -3.8) PCR ئۈنۈمىنى كۆرسىتىدۇ
· 3.322 دىن چوڭ يانتۇلۇق (مەسىلەن ، -3.0) PCR ئۈنۈمىنىڭ% 100 تىن يۇقىرىدەك كۆرۈنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ قىزىقارلىق ، PCR نىڭ بىر دەۋرىيلىكى قانداق قىلىپ كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ ئىككى ھەسسىسىدىن كۆپرەك ھاسىل قىلالايدۇ؟بۇ ئەھۋال PCR رېئاكسىيەسىنىڭ سىزىقسىز باسقۇچىدا يۈز بېرىدۇ ، يەنى زور مىقداردا ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىش بار.
ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى
QPCR كېڭەيتىش تاماملانغاندىن كېيىن ، PCR مەھسۇلاتى قىزىتىلىدۇ.تېمپېراتۇرىنىڭ ئۆرلىشىگە ئەگىشىپ ، قوش يۆنىلىشلىك كۈچەيتمە مەھسۇلات تەدرىجىي ئېرىپ ، فلۇئورېسسېنسىيەنىڭ كۈچلۈكلۈك دەرىجىسى تۆۋەنلەيدۇ.مەلۇم تېمپېراتۇرا (Tm) غا يەتكەندە ، نۇرغۇن مەھسۇلاتلار ئېرىپ كېتىدۇ.فلۇئورېسسېنسىيە تېز تۆۋەنلەيدۇ.ئوخشىمىغان PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ ئوخشىمىغان Tm قىممىتى ۋە ئوخشىمىغان ئېرىتىش تېمپېراتۇرىسى بار ، شۇڭا PCR نىڭ كونكرېتلىقىنى بىلگىلى بولىدۇ.
ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى (تۇغۇندى ئەگرى سىزىق)
ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى چوققا خەرىتە ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ھاسىل قىلىنغان بولۇپ ، PCR مەھسۇلات پارچىلىرىنىڭ ئەھۋالىنى تېخىمۇ بىۋاسىتە كۆرسىتىپ بېرەلەيدۇ.ئېرىتىش تېمپېراتۇرىسى DNA پارچىسىنىڭ Tm قىممىتى بولغاچقا ، DNA پارچىسىنىڭ Tm قىممىتىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان بەزى پارامېتىرلارغا ھۆكۈم قىلىشقا بولىدۇ ، مەسىلەن بۆلەكنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى ، GC مەزمۇنى قاتارلىقلار. ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، بىزنىڭ دەسلەپكى لايىھىلەش پرىنسىپىمىزغا ئاساسەن ،كۈچەيتىلگەن مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى 80-300bp ئارىلىقىدا ، شۇڭا ئېرىش تېمپېراتۇرىسى 80 سېلسىيە گرادۇستىن 90 سېلسىيە گرادۇسقىچە بولۇشى كېرەك.
ئېرىتىش ئەگرى سىزىقىنى ئىزاھلاش: ئەگەر بىردىنبىر ئاساسلىق چوققا 80 ° C-90 ° C ئارىلىقىدا كۆرۈنسە ، بۇ فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR نىڭ مۇكەممەل ئىكەنلىكىدىن دېرەك بېرىدۇ.ئەگەر ئاساسلىق چوققا 80 ° C-90 ° C ئارىلىقىدا بولسا ، ھەرخىل چوققىلار 80 سېلسىيە گرادۇستىن تۆۋەن بولسا ، دەسلەپكى ۋاقىت سىزىقى ئاساسەن ھېسابلىنىدۇ.ئۇنى ھەل قىلىش ئۈچۈن قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى ئاشۇرۇشقا ئۇرۇنسىڭىز بولىدۇ.ئەگەر ئاساسلىق چوققا 80 ° C-90 ° C ئارىلىقىدا كۆرۈلسە ، تېمپېراتۇرا ئۆرلىگەندە ھەر خىل چوققا يەنە پەيدا بولسا ، ئاساسەن DNA نىڭ بۇلغىنىشى بار دەپ قارىلىدۇ ، تەجرىبىنىڭ دەسلەپكى باسقۇچىدا DNA نى ئېلىۋېتىش كېرەك.
ئەلۋەتتە ، يەنىلا بىر قىسىم بىنورمال ئەھۋاللار بار ، بۇلار تۆۋەندە بىر-بىرلەپ پارچىلىنىدۇ.
3. ئىلغار بىلىملەر
QPCR قىلىش ئۈچۈن ، مەن MIQE دېيىشىم كېرەك ،ئەڭ تۆۋەن ئۇچۇرfor Publication ofسانReal-Time PCRتەجرىبە - ھەقىقىي مىقداردىكى PCR ھەققىدىكى ماقالىلەرنى ئېلان قىلىشنىڭ ئەڭ تۆۋەن ئۇچۇرىتەجرىبە.كۆپچىلىكنىڭ چۈشىنىشىنى ئاددىيلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، ئاچقۇچلۇق مەزمۇننى ئاددىيلاشتۇرىمىز.
سىز MIQE نىڭ ئەسلى تېكىستىنى توردىن ئىزدىسىڭىز بولىدۇ ، ئەڭ مۇھىمى ئۇنىڭدا بەلگىلەنگەنماقالە ئېلان قىلغاندا تەمىنلەشكە تېگىشلىك سانلىق مەلۇمات تەكشۈرۈش تىزىملىكى .
باھالىغۇچىلار بۇ تەپسىلاتلارنى ئوقۇش ئارقىلىق سىناقنىڭ سۈپىتىگە ھۆكۈم قىلالايدۇ.كەلگۈسىدىكى ئوقۇرمەنلەرمۇ بۇنى ئىشلىتىپ تەجرىبىنى تەكرارلايدۇ ياكى ياخشىلايدۇ.
دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى ، بۇ تىزىملىكتە ھەر بىر تىزىملىكنىڭ مۇھىملىقىغا ئايرىم-ئايرىم ھالدا E ياكى D بەلگىسى قويۇلغان.بۇ نېمىدىن دېرەك بېرىدۇ؟E: مۇھىم ئۇچۇرلار (تاپشۇرۇش كېرەك)D: كۆڭۈلدىكىدەك ئۇچۇرلار (ئىمكانقەدەر تەمىنلەڭ).
MIQE (1) - تەجرىبە لايىھىسى
ئاسپىرانتلىقتا ئوقۇشنى تاماملىغاندىن كېيىن مۇداپىئەسىنى تاماملىغان نۇرغۇن ئەخلەتلەر تەجرىبە قانداق لايىھىلەشنى بىلمەيدۇ ، دەپتىرىنى ئاچىدۇ ۋە ئوقۇتقۇچىنىڭ دېگىنىنى قىلىدۇ.نەتىجىدە ، تەجرىبە لايىھىسى قاتتىق بولمىدى ، ژۇرنالنىڭ تەھرىر بۆلۈمى ئۆزلىرىنىڭ بۇ رەسىم ۋە بۇ رەسىمنى ياساشنى خالايدىغانلىقىنى ، شۇڭا ئۇنى ھەيرانلىق بىلەن قىلغانلىقىنى ئېيتتى.ئەخلەت ساندۇقى مانا مۇشۇنداق ياسالغان!
ئۆيگە يېقىنراق ، سىناقنىڭ بىرىنچى پرىنسىپى ئېنىقلاشتەجرىبە لوگىكىسىنىڭ قاتتىقلىقى.ئەڭ نېگىزلىك نەرسە تەجرىبە لايىھىسى ، تەجرىبە لايىھىسىدىكى ئەڭ مۇھىمى نىشان ئەۋرىشكىسى ، پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسى (كونترول) ۋە تەكرارلاش قېتىم سانىنى قانداق بەلگىلەش ، تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىنى پايدىلىنىشقا ، سېلىشتۇرۇشقا ۋە قايىل قىلىشقا بولىدۇ.
نىشان ئەۋرىشكىسىمەلۇم بىر داۋالاشتىن كېيىن بىزدىن نىشانلىق گېننى بايقاشنى تەلەپ قىلىدىغان ئەۋرىشكىنى كۆرسىتىدۇ.پايدىلىنىش ئەۋرىشكىسىھېچقانداق داۋالاش ئېلىپ بېرىلمىغان ئەۋرىشكە ، بۇ كۆپىنچە بىئولوگىيەدىكى ياۋا تىپ دەپ ئاتىلىدۇ.
تەجرىبە تەكرارلىنىدۇئىنتايىن مۇھىم.ئادەتتە ، قايىل قىلارلىق كۆپەيتكۈچىلەر چوقۇم ئۈچتىن كۆپ بولۇشى كېرەك.بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىشنىڭ نېمىلىكىنى ۋە تېخنىكىلىق كۆپەيتىشنىڭ نېمە ئىكەنلىكىنى پەرقلەندۈرۈش كېرەك.
Biological Replicates: ئوخشىمىغان ماتېرىياللار (ۋاقىت ، ئۆسۈملۈكلەر ، تۈركۈملەر ، ئىنكاس تاختىلىرى) بىلەن ئېلىپ بېرىلغان ئوخشاش دەلىللەش تەجرىبىسى.
بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىش
مۇچنى دېھقانچىلىق دورىسى بىلەن داۋالاشنى مىسالغا ئالايلى.بىز ABC نىڭ ئۈچ زاۋۇتىغا دېھقانچىلىق دورىسى پۈركۈشنى خالايمىز ، ئاندىن ABC نىڭ ئۈچ زاۋۇتى ئۈچ خىل بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىلگەن ، ئۇلار ئوخشاش بولمىغان ماتېرىياللار بىلەن ئېلىپ بېرىلغان ئوخشاش دەلىللەش تەجرىبىسى.ئەمما تەجرىبە سۈپىتىدە ، چوقۇم كونترول قىلىش كېرەك ، شۇڭا بىز A ئۆسۈملۈكنىڭ شاخلىرىدىن بىرنى پۈركۈپ A ئۆسۈملۈك تەجرىبە گۇرۇپپىسىنى قۇرالايمىز ، ھەمدە A ئۆسۈملۈكنىڭ باشقا شاخلىرىنى پۈركۈپ كونترول گۇرۇپپىسى قۇرالمايمىز.B ۋە C غا ئوخشاش قىلىڭ.
تېخنىكىلىق تەكرارلاش (تېخنىكىلىق كۆپەيتىش): بۇ مەشغۇلات كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان خاتالىقلاردىن ساقلىنىش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن قايتا-قايتا سىناق بولۇپ ، ئەمەلىيەتتە ئوخشاش ماتېرىيالغا كىرگۈزۈلگەن كۆپەيتىلگەن تۆشۈك.ھەر ئىككى خىل داۋالاش ۋە كونترول قىلىشتا چوقۇم نىشان گېنى ۋە ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ كۆپەيتىلگەن تەڭشىكى بولۇشى كېرەك.
تېخنىكىلىق تەكرارلاش
دېھقانچىلىق دورىسى بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان قىزىلمۇچنى يەنە بىر مىسالغا ئالايلى.A ئۆسۈملۈك تەجرىبە گۇرۇپپىسى ئۈچۈن ، بىز نىشانلىق گېن ۋە ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئۈچۈن ئايرىم-ئايرىم ھالدا 1 ، 2 ۋە 3 دىن ئىبارەت ئۈچ PCR تۆشۈك ياساپ چىقتۇق ، شۇڭا بايقالغاندىن كېيىن ئوتتۇرىچە قىممەت ئالدۇق.ئۆسۈملۈكلەرنى كونترول قىلىش ئۈچۈن A گۇرۇپپىلارغىمۇ ئوخشاش مۇئامىلە قىلىنىدۇ.ئوخشاشلا B ۋە C ئۆسۈملۈكلىرىگە ئوخشاش داۋالاشنى قىلىڭ.بۇ تېخنىكىلىق تەكرارلاش.
دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكىستاتىستىكىغا كىرگەن نەرسە بىئولوگىيىلىك تەكرارلاش بولۇپ ، تېخنىكىلىق تەكرارلاش تەجرىبە جەريانىدا تاسادىپىي ھادىسە بار-يوقلۇقىنى سىناش ، شۇڭا تەجرىبە نەتىجىسىنى ئىشەنچلىك قىلىش ، يەنى بىز دائىم دېگىنىمىزدەك ئوتتۇرىچە قىممەتنى ئېلىپ خاتالىقلاردىن ساقلىنىش.
سەلبىي كونتروللار - NTC ۋە NRT
NTC (قېلىپسىز كونترول)، قېلىپسىز كونترول ، تەجرىبە ماتېرىياللىرىنىڭ بۇلغانغان ياكى ئەمەسلىكىنى دەلىللەشكە ئىشلىتىلىدۇ.ئادەتتە سۇ قېلىپ سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.ئەگەر فلۇئورېسسېنسىيە رېئاكسىيەسى بولسا ، بۇ تەجرىبىخانىدا يادرو كىسلاتاسىنىڭ بۇلغىنىشىنىڭ يۈز بەرگەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ.
بۇ بۇلغىنىشلار: پاسكىنا سۇ ، ئىچكى مەنبەلىك DNA بار لاياقەتسىز رېئاكتور ، دەسلەپكى بۇلغىنىش ، تەجرىبىخانا ئۈسكۈنىلىرىنىڭ بۇلغىنىشى ، ئايروسولنىڭ بۇلغىنىشى قاتارلىقلار ، RNase تازىلاش ماشىنىسى ۋە RNase چەكلىگۈچنى ئىشلىتىشى كېرەك.ئاۋىئاتسىيەنىڭ بۇلغىنىشىنى تېپىش ئەڭ قىيىن.تەجرىبىخانىڭىزنىڭ تۇمانغا ئوخشايدىغانلىقىنى تەسەۋۋۇر قىلىپ بېقىڭ ، ھەر خىل يادرو كىسلاتالىرى ھاۋادا توختىتىلغان.
NRT (No-Reverse Transcriptase)، تەتۈر ترانسكرىپسىيەسىز كونترول ، تەتۈر كۆچۈرۈلمىگەن RNA مەنپىي كونترول ، يەنى gDNA قالدۇقىنى كونترول قىلىش.
گېن ئىپادىلەشتە ، RNA نىڭ مىقدارى تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن cDNA نىڭ مىقدارىنى بايقاش ئارقىلىق بايقىلىدۇ.ئەگەر RNA ساپلاشتۇرۇلغاندا gDNA قالدۇقى بولسا ، ئۇ تەجرىبە نەتىجىسىدە خاتالىق پەيدا قىلىدۇ ، چۈنكى ئېرىشكەن ئەمەلىي نەتىجىلەر gDNA ۋە cDNA.ئومۇمىي سەۋىيىدە ، پەقەت CDNA بولۇپلا قالماي ، RNA ئېلىش جەريانىدا gDNA نى پۈتۈنلەي ئېلىۋېتىش كېرەك.
MIQE (2) - ئۈلگە ئۇچۇر
ئاتالمىش ئەۋرىشكە ئۇچۇرلىرى qPCR ھەققىدە ماقالە ئېلان قىلغاندا ، ئەۋرىشكە ئۇچۇرلىرىنى ئېنىق چۈشەندۈرۈشىمىز كېرەكلىكىنى كۆرسىتىدۇ ، بۇ ماقالىنىڭ كەم بولسا بولمايدىغان بىر قىسمى.ئوخشاشلا ، ئەۋرىشكە بىر تەرەپ قىلغاندا ، ئەۋرىشكىنىڭ توغرىلىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ئۆزىمىزنىڭ مەشغۇلاتىنىمۇ تەڭشىشىمىز كېرەك.
ئەۋرىشكىنىڭ چۈشەندۈرۈشى پەقەت بىر نەتىجە ، بىز پۈتكۈل سىناق جەريانىدا ئېلىنغان ماتېرىياللارغا تېخىمۇ ئەھمىيەت بېرىشىمىز كېرەك.
تەجرىبە ماتېرىياللىرىنى تاللاش
قان ئەۋرىشكىسى - يېڭى قاننى تاللاڭ ، 4 سائەتتىن ئېشىپ كەتمەيدۇ.ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسى - كۈچلۈك ئۆسۈپ يېتىلىش مەزگىلىدە يېڭى ھۈجەيرىلەرنى توپلاشنى تاللاڭ.ھايۋانات توقۇلمىلىرى - يېڭى ، كۈچلۈك ئۆسۈۋاتقان توقۇلمىلارنى تاللاڭ.ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرى - يېڭى ، ياش توقۇلمىلارنى تاللاڭ.
سىز چوقۇم بۇ بىر نەچچە جۈملىدە ئاچقۇچلۇق سۆزنىڭ بارلىقىنى بايقىغان بولۇشىڭىز كېرەك: يېڭى.
يۇقارقى ئەۋرىشكەلەرگە نىسبەتەن ، بازاردىكى ئەڭ ياخشى ، تېجەشلىك ۋە مۇقىم يۈرۈشلۈك زاپچاس Foregene نىڭ زاپچاسلىرى بولۇپ ، ئۇلارنىڭ DNA ۋە RNA نى تېز ۋە ئاسان ئالالايدۇ.
ھايۋانلارنىڭ ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى
ئۆسۈملۈك ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى
ئۆسۈملۈك ئومۇمىي RNA ئايرىۋېتىش زاپچاسلىرى
تەجرىبە ماتېرىياللىرىنى ساقلاش
ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، شارائىت يار بەرسە ئەۋرىشكە ساقلاشنى تەۋسىيە قىلمايمىز.قانداقلا بولمىسۇن ، نۇرغۇن دوستلار ئەۋرىشكە ئېلىپ بولغاندىن كېيىنلا تەجرىبە ئېلىپ بارالمايدۇ ، ھەتتا بەزىلىرى ئەۋرىشكە ئۈچۈن سۇيۇق ئازوت باكىنى ئېلىپ ئېتىزغا ئېلىپ بېرىشى كېرەك.
بۇ خىل تىرىشچان دوست ئۈچۈن ، مەن پەقەت رېئاكتىپ ئىستېمال بۇيۇملىرىنى چۈشەنمەيدىغانلىقىنى ئېيتالايمەن.ھازىر نۇرغۇن رېئاكتىپ ئىستېمال قىلىدىغان شىركەتلەر RNA ئەۋرىشكىسىنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ساقلىيالايدىغان رېئاكتور ئىشلەپچىقىرىدۇ ، ئىشلىتىشنى تاللىسىڭىز بولىدۇ.ئادەتتىكى ساقلاش ئۇسۇلى سۇيۇق ئازوت ساقلاش بولۇپ ، ئېلىپ يۈرۈشكە قۇلايلىق بولغان كىچىك سۇيۇق ئازوت باكى ئىشلىتىلىدۇ.ئەۋرىشكىنى تەجرىبىخانىغا قايتۇرۇپ كەلگەندىن كېيىن ، -80 سېلسىيە گرادۇسلۇق توڭلاتقۇدا ساقلاڭ.
RNA غا مۇناسىۋەتلىك تەجرىبىلەر ئۈچۈن ، ئالتە سۆزلۈك پرىنسىپقا ئەمەل قىلىش كېرەك:تۆۋەن تېمپېراتۇرا ، فېرمېنت يوق ،ۋەتېز .
تۆۋەن تېمپېراتۇرا ئۇقۇمىنى چۈشىنىش ئاسان.فېرمېنت بولمىسا ، RNase بىز ياشاۋاتقان دۇنيانىڭ ھەممە يېرىدە (بولمىسا سىز ئەيدىز ۋىرۇسى بىلەن ئۆلتۈرۈلگەن بولاتتىڭىز) ، شۇڭا تەجرىبە قىلغاندا RNase دىن قانداق ساقلىنىش ئىنتايىن مۇھىم ئۇقۇم.fast,دۇنيادا بۇزۇلمايدىغان كۇڭ فۇ يوق ، پەقەت سۈرئەتنى بۇزغىلى بولمايدۇ.
شۇڭلاشقا ، مەلۇم مەنىدىن ئېيتقاندا ، ئېلىش ۋاقتى قانچە قىسقا بولسا ، زاپچاس شۇنچە ياخشى بولىدۇ.نېمىشقا قىلىدۇForegene'يۈرۈشلۈك زاپچاسلار سۈرئەتنى تەكىتلەيدۇ ، چۈنكى ئۇلار ئۇنى ئوبدان بىلىدۇ.
PS: بەزى قىزلار ناھايىتى ئەستايىدىللىق بىلەن تەجرىبە قىلىدۇ ، ئەمما ئۇلار بىر نەچچە يىل ئىشلىگەندىن كېيىن ئۇششاق ئەخلەتتەك ياخشى ئەمەس.ئۇلار تەڭرىنىڭ ئادالەتسىزلىكىنى ، باشقىلاردىن ئاغرىنىپ ، ھايات ئىزدەۋاتقانلىقىنى ھېس قىلىدۇ.ئەمەلىيەتتە ، ئۇ بۇنى چۈشەنمىدى.ئۇ RNA نى ياخشى قوغدىيالمىدى ، ئەخلەت ساندۇقى قويغۇچ چاققان ئىدى.ئۇ تەجرىبە قىلىۋاتقاندا ، ئۇ ئەخلەت ساندۇقىنى ئۈچ قېتىم ، بەش قېتىم ۋە ئىككى بۆلۈش ئارقىلىق تاماملايمەن دەپ ئويلىغان ، ئەمما ئۇ سىناقنى ياخشى قىلغان.
دىققەت: ئاستا ، RNase نىڭ تاجاۋۇز قىلىش ئېھتىماللىقى تېخىمۇ يۇقىرى.تېز بولۇش ئۈچۈن ئۆزىڭىزنى قانداق مەشىقلەندۈرۈش كېرەك؟ئامال يوق ، پەقەت كۆپرەك مەشىق قىلىڭ.
ئوخشىمىغان تەجرىبە ۋە ئوخشىمىغان ئەۋرىشكە ئۈچۈن ، يەنىلا تېخىمۇ كۆپ ئەدەبىياتنى ئوقۇش ۋە مۇۋاپىق بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇلىنى تاللاش كېرەك.ئەۋرىشكە يىغىش ۋە ساقلاش جەريانى ئۈچۈن ، MIQE چوقۇم چوقۇم قەغەزگە ئېنىق يېزىلىشىنى تەلەپ قىلىدۇ ، بۇنداق بولغاندا باھالىغۇچىلار قەغەزنىڭ ئىشەنچلىكلىكىنى تەكشۈرەلەيدۇ ، ھەيران قالغان ياشلارنىڭ تەجرىبىڭىزنى تەكرارلىشىمۇ قۇلايلىق.
گەرچە بىئولوگىيىلىك تەجرىبە قىيىن بولسىمۇ ، ئەمما ئۇلار ئالىي دەرىجىلىك.ئەگەر ئېھتىيات قىلمىسىڭىز ، دۇنيانى ئاغدۇرۇپ تاشلىيالايسىز.مەسىلەن ، SARS نى بىئو-خىمىيىلىك كرىزىسقا ئايلاندۇرۇش ياكى ئارىلاشما گۈرۈچ ياساش ئارقىلىق 1 مىليارد 300 مىليون ئادەمنى قۇتقۇزۇش.تۆۋەندىكى رەسىم بىر خىمىيىلىك تەجرىبە ، سىز ئۇنىڭ بوياق قىياپىتىگە قاراپلا تەتقىقاتىڭىزدىن قانچىلىك پەخىرلىنىسىز.ئۇنى ئۇنتۇپ كېتىڭ ، ئۇنى قارا قويماڭ.
MIQE (3) - يادرو كىسلاتاسى ئېلىش.
يادرو كىسلاتاسىنى ئېلىش بىر چوڭ ھادىسە ، بارلىق مولېكۇلا بىئولوگىيە تەجرىبىسى يادرو كىسلاتاسىنى ئېلىشتىن باشلىنىدۇ.ئالدى بىلەن ، MIQE نىڭ يادرو كىسلاتاسىنى ئېلىشتىكى مەزمۇنىنى كۆچۈرەيلى.
بۇ جەدۋەلگە قارايدىغان بولساق ، يەر يۈزىدە تۇرالمايسىز.شەكلى بىر دوگما.ئالدىنقى قاتاردىكى ئوقۇغۇچى بولۇش ئۈچۈن ، بۇنىڭ سەۋەبىنى سورىشىڭىز كېرەك.بۇ جەدۋەلنىڭ مۇھىم مەزمۇنى: قوغلاشRNA نىڭ ساپلىقى ، مۇكەممەللىكى ، ئىزچىللىقى ۋە ئېلىش مىقدارى .
بىرىنچى قىسمىجەريان ياكى ئەسۋاب يادرو كىسلاتاسىنى ئېلىش باسقۇچى.ئەگەر سىز ئاپتوماتىك يادرو كىسلاتاسى چىقارغۇچىنى ئىشلەتسىڭىز (ئىلغار ، مەن بىلەن ئالاقىلىشىڭ) ، بۇ ئەسۋابنىڭ مودېل نامىنى كۆرسىتىشىڭىز كېرەك.
يۈرۈشلۈكنىڭ ئىسمى ۋە
ئۆزگەرتىش تەپسىلاتلىرىغا قانداق زاپچاس ئىشلىتىلگەنلىكى ، قانداق ئالاھىدە رېئاكتور قوشۇلغانلىقى ياكى قانداق ئالاھىدە مەشغۇلاتلارنىڭ ئېلىپ بېرىلغانلىقىنى ئېنىق چۈشەندۈرۈپ ، باشقىلار سىزنىڭ تەجرىبىڭىزنى ئاسانلا تەكرارلىيالايدۇ.
بەزى كىشىلەر ئالاھىدە ئەۋرىشكە ئالغاندا بەزى ئالاھىدە رېئاكتورلارنى قوشىدۇ ، بۇ ئۇلارنىڭ مەخپىي قورالى دەپ ئويلاپ ، باشقىلارغا ئېيتمايدۇ.ئۇنى مەخپىي تۇتۇش بىلەن بىللە ، ئۇلار يەنە ماقالىڭىزنى پارلاق قىلىش پۇرسىتىدىن مەھرۇم قالىدۇ.ئەقىللىق بولماڭ ، ئىلمىي تەتقىقاتتا دۆلەت كونا جاڭدىنمۇ سەمىمىي بولۇشىڭىز كېرەك ، ئەگەر ئەقىللىق بولماقچى بولسىڭىز ، ماقالە سىزنى ئەخمەق قىلىدۇ.
يۈرۈشلۈك مەھسۇلاتنىڭ مەھسۇلات نومۇرىنى ئەستە ساقلىشى كېرەكزاپچاسنى زاكاز قىلىپ ماقالە يازغاندا.يۈرۈشلۈك زاپچاسلاردا ئادەتتە ئىككى سان بار: مۈشۈك - مۇندەرىجە نومۇرى (مەھسۇلات نومۇرى ، ماقالە نومۇرى) ، لوت - مەھسۇلات نومۇرى (مەھسۇلاتنىڭ قايسى تۈركۈمدىن كەلگەنلىكىنى كۆرسىتىشكە ئىشلىتىلىدۇ).
ئۇنىڭدىن باشقا ، CAS نومۇرى بىئو-خىمىيىلىك رېئاكتورنى زاكاز قىلغاندا دائىم ئىشلىتىلىدۇ ، مەن ئۇنى بىرلىكتە ئومۇملاشتۇرىمەن.CAS نومۇرى ئامېرىكا خىمىيىلىك جەمئىيىتىنىڭ ھەر بىر يېڭى خىمىيىلىك دورىغا بەرگەن نومۇرى.ئادەتتە ، ئۈچ سان بىر سىزىق ئارقىلىق ئۇلىنىدۇ.رۇشۈينىڭ CAS نومۇرى: 7732-18-5.خىمىيىلىك ماددىلارنىڭ دائىم كۆپ خىل ئىسمى بار ، ئەمما CAS نومۇرى ئۆزگىچە.دورا زاكاز قىلغاندا ، ئالدى بىلەن ئۇنىڭ CAS نومۇرىنى تەكشۈرسىڭىز بولىدۇ.
ئۆيگە يېقىنراق ، بىز نېمىشقا بۇ ئىشلارنى ئېنىق تەسۋىرلىشىمىز كېرەك؟ئەمەلىيەتتە ، ئۇ يەنە RNA ئېلىش سۈپىتىنى تەكشۈرۈش.چالغۇ ۋە زاپچاسلارنى ئىشلىتىش RNA ئېلىشنى تېخىمۇ ئىزچىللاشتۇرىدۇ.ئادەتتىكى تەجرىبىخانىلارنىڭ ئېلىش كۆلىمى ئانچە چوڭ ئەمەس ، ئۇنى زاپچاسلار بىلەن ئېرىشكىلى بولىدۇ.
DNase ياكى RNase داۋالاشنىڭ تەپسىلاتلىرى
فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR نىڭ مۇھىم مەسىلىسى DNA نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ، ئەگەر بۇلغىنىش بولسا تەجرىبە قىلماڭ.شۇڭلاشقا ، تەجرىبە جەريانىدىكى DNA نىڭ پۈتۈنلەي ۋە پۈتۈنلەي ئېلىۋېتىلگەنلىكىنى ئىسپاتلاش ئۈچۈن ، سىز DNA نى بىر تەرەپ قىلىش جەريانىدا ئىشلەتكەن جەرياننى بايان قىلىش تولىمۇ زۆرۈر.سىخېما دىئاگراممىسى بىلەن ئىپادىلىنىدۇ.
RNA ۋە DNA نىڭ سىخېما دىئاگراممىسى
ئادەتتە ، DNA نى چىقىرىۋېتىشنىڭ ئۇسۇلى RNA نى DNase ئارقىلىق داۋالاشتىن كېيىن داۋالاش.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇلار بىر قەدەر كونا ئۇسۇللار.سودا RNA ئېلىش زاپچاسلىرى DNase نى قوشمايلا ئېلىش جەريانىدا DNA نى ئېلىۋېتەلەيدۇ.مەسىلەن ، Foregene دىن كەلگەن بىر يۈرۈش زاپچاسلار.
دىققەت: RNA ئېلىش جەريانىدا DNA نى ئېلىۋېتىش ئىنتايىن خەتەرلىك قوش بىسلىق قىلىچ ، ئۇ RNA ئېلىشنىڭ مەشغۇلات ۋاقتىنى ئۇزارتىدۇ ۋە RNA نىڭ بۇزۇلۇش خەۋىپىنى ئاشۇرۇۋېتىدۇ.ئاساسىي جەھەتتىن ، ئۇ RNA ھوسۇلى بىلەن ساپلىق ئوتتۇرىسىدىكى سودا.
ئۇنىڭدىن باشقا ، سىلتسىينى ئاساس قىلغان سۈمۈرۈلۈش ستونىغا قوشۇلغان DNase نىڭ مىقدارى ئىنتايىن ئاز ، ئۈنۈمگە ئېرىشىش ئۈچۈن چوقۇم يۇقىرى سۈپەتلىك DNase ئىشلىتىش كېرەك.ئىشلىتىلمىگەن DNase نى تېز ۋە تولۇق ھەزىم قىلىشقا بولمايدۇ.بۇ سودىگەرنىڭ تېخنىكىلىق سەۋىيىسىنىڭ سىنىقى.ئەلۋەتتە ، DNase بولمىسا DNA نى ئېلىۋەتكىلى بولىدۇ دەپ ماختىنىدىغان تېخىمۇ غەلىتە سودىگەرلەرمۇ بار.شۇنداق دېيىشكە بولىدۇكى ، DNase بولمىسا DNA نى پۈتۈنلەي ئۆچۈرۈۋەتكىلى بولىدۇ دەپ ماختىنىدىغانلار ئالدامچىلىق.DNA بىر قەدەر تۇراقلىق قوش سىزىقلىق قۇرۇلما بولۇپ ، ئۇنى سۆزلەش ۋە كۈلۈش ئارقىلىقلا ئۆچۈرگىلى بولمايدۇ.
بۇلغىنىشنى باھالاش
باھالاش ئۇسۇلى: ئېلېكتروفورېزنى تەكشۈرۈش ،% 1 ئاگاروزا ، 6V / cm ، 15 مىنۇت ، يۈك 1-3 ul
يادرو كىسلاتاسىنىڭ مىقدار ئانالىزى
ئادەتتە ئۇلترا بىنەپشە نۇر سپېكترى ئۆلچەش ئەسۋابى ئارقىلىق ئۆلچىنىدۇ.مەن ئالدى بىلەن OD260 ، OD280 ۋە OD230 دىن ئىبارەت ئۈچ قىممەتنىڭ مەنىسىنى تەشۋىق قىلاي.
· OD260nm: ئۇ يادرو كىسلاتاسىنىڭ ئەڭ يۇقىرى سۈمۈرۈلۈش چوققىسىنىڭ سۈمۈرۈلۈش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى ، ئەڭ ياخشى ئۆلچەنگەن قىممىتى 0.1 دىن 1.0 گىچە.ئەگەر ئۇنداق بولمىسا ، ئەۋرىشكىنى سۇيۇلدۇرۇڭ ياكى مەركەزلەشتۈرۈڭ.
· OD280nm: ئۇ ئاقسىل ۋە فېنولىك ماددىلارنىڭ ئەڭ يۇقىرى سۈمۈرۈلۈش چوققىسىنىڭ سۈمۈرۈلۈش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى.
· OD230nm: ئۇ كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ ئەڭ يۇقىرى سۈمۈرۈلۈش چوققىسىنىڭ سۈمۈرۈلۈش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى.
كېيىنكى قەدەمدە ، ھەر بىر كۆرسەتكۈچنىڭ رولى ھەققىدە سۆزلەيلى.A260 ئۈچۈن ، ئۇنى يادرو كىسلاتاسىنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئۆلچەشكە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.OD260 = 1 بولغاندا ، dsDNA = 50μg / ml ، ssDNA = 37μg / ml ، RNA = 40μg / ml.
پاكلىق ئۈچۈن ، بىز دائىم كۆرىدىغان نىسبەتلەرگە دىققەت قىلىشىمىز كېرەك: OD260 / 280 ۋە OD260 / 230.
· ساپ DNA: OD260 / 280 تەخمىنەن 1.8 گە تەڭ.ئۇ 1.9 دىن چوڭ بولغاندا ، RNA نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ بارلىقىنى ، 1.6 دىن تۆۋەن بولغاندا ، ئاقسىل ۋە فېنولنىڭ بۇلغىنىشىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىدۇ.
Pure RNA: 1.7
· OD260 / 230: مەيلى DNA ياكى RNA بولسۇن ، پايدىلىنىش قىممىتى 2.5.2.0 دىن تۆۋەن بولغاندا ، ئۇ شېكەر ، تۇز ۋە ئورگانىك ماددىلارنىڭ بۇلغىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ.
RNA سەمىمىيىتى
RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى ئۆلچەش ئىنتايىن مۇھىم.ئادەتتە ، 28S بىلەن 18S RNA ئارىسىدىكى يورۇقلۇقنىڭ ئىككى ھەسسە مۇناسىۋىتى بار-يوقلۇقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن RNA ئايرىش گېلى تەجرىبىسى قىلىش كېرەك.ئۈچىنچى گۇرۇپپا 5S پەيدا بولغاندا ، ئومۇرتقىسىز ھايۋانلارنى ھېسابقا ئالمىغاندا ، RNA نىڭ چېكىنىشكە باشلىغانلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ.
RNA سۈپىتىنى باھالاشتىكى سانلىق مەلۇماتلار: يۇقارقى سىناقلاردىن باشقا ، RNA پۈتۈنلۈكى جەھەتتە يەنە بىر قىسىم ئىلغار قوراللار سىناقلىرىمۇ بار ، مەسىلەن تەجرىبە ئاپتوماتىك ئېلېكتروفورېز سىستېمىسىنىڭ RQI پۈتۈنلۈكى سىنىقى ، بۇ RNA نىڭ كۆرۈنمەس دەرىجىدە تۆۋەنلىگەنلىكىنى تەكشۈرەلەيدۇ.
ئىلمىي تەتقىقاتتا ، فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR نىشان گېن بىلەن ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئوتتۇرىسىدىكى سېلىشتۇرما.شۇڭلاشقا ، RNA ئەۋرىشكىسىنى قوغداش ، RNA ئېلىش قاتارلىق جەريانلاردا ، ئاساسلىق مەقسەت RNA نىڭ مۇكەممەللىكىگە كاپالەتلىك قىلىش.
RNA نىڭ مۇكەممەللىكى نىشان گېن بىلەن ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئوتتۇرىسىدىكى تەڭپۇڭلۇققا قانداق تەسىر كۆرسىتىدۇ ، تۆۋەندىكى رەسىمدىن ئاسانلا چۈشىنىشكە بولىدۇ.ناچارلىشىش گېننىڭ تولۇق بولماسلىقىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، مەيلى ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ تولۇق بولماسلىقى ياكى نىشان گېنىنىڭ تولۇق بولماسلىقىدىن قەتئىينەزەر ، ئۇ سانلىق مەلۇماتلارغا زور تەسىر كۆرسىتىدۇ.
نىشانلىق گېن ۋە پايدىلىنىش گېنىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى توغرا بولماسلىقى كېرەك
چەكلەش سىنىقى (مەيلى CT قىممىتى يۇقىرى ياكى تۆۋەن قويۇقلۇقتا ياكى باشقا شارائىتتا بېسىلغان بولسۇن)
بۇ ساننى مىسالغا ئالساق ، بەش ئەگرى سىزىقنىڭ Ct قىممىتى تۆۋەندىكىچە.ئەگرى سىزىقلار ئارىسىدىكى CT قىممىتىنىڭ تارقىلىشى تەكشى ئەمەس ، Ct قىممىتى يۇقىرى ۋە تۆۋەن قويۇقلۇقتا كېچىكىدۇ ، بۇ PCR چەكلەنگەن ئەھۋال.
مۇھىم نۇقتا: RNA ئېلىش جەريانىدا ، بىز خاتا قاراشتىن ۋاز كېچىپ ، توغرا قاراشلارنى ئورنىتىشىمىز كېرەك.
خاتا قاراش: RNA ئېلىش پەقەت ھوسۇلنى قوغلىشىدۇ ، RNA ئېرىشكەن مىقدارى قانچە كۆپ بولسا شۇنچە ياخشى دەپ ئويلايدۇ.ئەمەلىيەتتە ، مىقدارلاشتۇرغاندا ، گېن سانى بەك كۆپ بولمىسا ، بىز RNA غا ئانچە ئېھتىياجلىق ئەمەس.سىز چىقارغان RNA نىڭ مىقدارى يېتەرلىك ئەمەس.
توغرا ئۇقۇم:RNA ئېلىش ساپلىق ، سەمىمىيەت ۋە ئىزچىللىقنى قوغلىشىشى كېرەك.ساپلىق كېيىنكى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ چەكلەنمەسلىكىگە ۋە سانلىق مەلۇماتلارنىڭ DNA نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىماسلىقىغا كاپالەتلىك قىلالايدۇ.سەمىمىيەت نىشان تەرتىپى ۋە ئىچكى پايدىلىنىشنىڭ تەڭپۇڭلۇقىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ.ئىزچىللىق ئەۋرىشكە يۈكلەشكە كاپالەتلىك قىلىدۇ.
MIQE (4) - تەتۈر كۆچۈرۈلۈش
خاتا قاراش: تېخىمۇ يۇقىرى ئەۋرىشكە ئاۋازىنى قوغلىشىش.
توغرا ئۇقۇم: ئىزچىللىق (مۇقىملىق) غا ئەگىشىڭ ، RNA نىڭ قانچىلىك يۈكلەنگەن بولۇشىدىن قەتئىينەزەر ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى ئىزچىل ساقلىنىپ ، cDNA پەرقىنىڭ mRNA دىكى پەرقنى ھەقىقىي ئەكس ئەتتۈرۈشىگە كاپالەتلىك قىلىدۇ.
بىز بۇ جەرياننى سىخېما دىئاگراممىسى بىلەن چۈشەندۈردۇق:
تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى توغرا ئەمەس
ئالدى بىلەن ، بىز تەتۈر كۆچۈرۈش جەريانى بىلەن PCR جەريانىنىڭ پەرقىنى چۈشىنىشىمىز كېرەك.PCR كۆپ قېتىم قىزىتىش ۋە ئۇلاش جەريانىنى باشتىن كەچۈردى ، نىشان بۆلەكلىرى شىددەت بىلەن ئۆسىدۇ.تەتۈر كۆچۈرۈلۈشتە بۇ جەريان بولمىسىمۇ ، بىز تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ ئەمەلىيەتتە بىرمۇ-بىر ئىكەنلىكىنى تەسەۋۋۇر قىلالايمىز.
نۇرغۇن CDNA ئۇچۇرلىرىغا ئېرىشەلەيدىغان بولغاچقا ، ئۇنى ھازىرچە چۈشىنىش كېرەك ، چۈنكى چوڭ-كىچىك پارچىلار تەتۈر كۆچۈرۈلگەن ، بىر پارچىغا دىققەت قىلىش مۇمكىن ئەمەس.ئۇنىڭ ئۈستىگە RNA نىڭ مىقدارى بىر قەدەر ئاز بولغاچقا ، ئېرىشىلگەن cDNA نىڭ مىقدارىمۇ بىر قەدەر ئاز ، كۈچەيتمە رولى بار PCR غا ئوخشىمايدۇ ، شۇڭا بايقاش ئاساسەن مۇمكىن ئەمەس.
cDNA ئېلېكتروفورېز نەتىجىسى
ئىككىنچىدىن ، ئەڭ ياخشىسى ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش بىرمۇبىر ئېلىپ بېرىلىدۇ ، ئەمما ھېچقانداق شىركەتتىن تەتۈر كۆچۈرۈلۈش بۇ ئۈنۈمگە ئېرىشەلمەيدۇ.ئاساسىي جەھەتتىن ، كۆپىنچە تەتۈر كۆچۈرۈلگەن خاتىرىلەرنىڭ ئۈنۈمى% 30-% 50 ئارىسىدا ئايلىنىپ يۈرىدۇ.ئەگەر بۇ خىل ئەھۋال بولسا ، بىز بىر قەدەر تۇراقلىق بولغان تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمىگە ئېرىشىشنى خالايمىز ، بۇ بىزنىڭ رەسىمدە كۆرمەكچى بولغىنىمىز: 3 RNA 2 CDNA ، 6 RNA 4 CDNA غا ئېرىشىدۇ ، شۇڭا قانچىلىك ئەۋرىشكە يۈكلەنگەن تەقدىردىمۇ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى بىر قەدەر مۇقىم بولىدۇ.بىز تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى تۇراقسىز ، قويۇقلۇقى يۇقىرى چەكلەنگەن ئەھۋالنى كۆرۈشنى خالىمايمىز.
ئۇنداقتا ، تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمىنىڭ مۇقىم ياكى ئەمەسلىكىنى قانداق دەلىللەش كېرەك؟بۇ ئۇسۇل ئىنتايىن ئاددىي ، سىز پەقەت سېلىشتۇرۇش سىنىقى قىلىشىڭىز كېرەك: بىرى RNA نىڭ ئىككى ھەسسىلەپ سۇيۇلۇشىدىن كېيىن CDNA غا تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ، يەنە بىرى cDNA غا تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن ھەسسىلەپ سۇيۇلدۇرۇش ، ئاندىن qPCR ئارقىلىق ئېرىشكەن يانتۇلۇقنى كۆرۈش بىردەكمۇ؟ئالدىنقى قاتاردىكى ئوقۇغۇچى بولۇش سۈپىتىڭىز بىلەن ئۇنى سېكۇنتتا چۈشىنىشىڭىز كېرەك.تۆۋەندە كۆرسىتىلگەندەك:
RNA ۋە cDNA نى كېڭەيتىپ ، تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمىنىڭ مۇقىم ياكى ئەمەسلىكىنى سىنايدۇ
تەتۈر كۆچۈرۈلمە زاپچاس ۋە زاپچاس
قانداق قىلغاندا فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدار PCR نىڭ ئەلا تەتۈر كۆچۈرۈلمىسى ۋە زاپچاسلىرى بولىدۇ.تەتۈر كۆچۈرۈلۈش مەنبەسى AMV ياكى مەنبەگە ئاساسەن ئاساسەن ئىككى خىلغا ئايرىلىدۇM-MLVھەمدە ئۇلارنىڭ ئىپادىسى جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن بىلەن ئوخشاش.
RNase H پائالىيىتى
RNase H بولسا Ribonuclease H ، خەنزۇچە ئىسمى ribonuclease H بولۇپ ، ئۇ DNA-RNA ئارىلاشما زەنجىرىدىكى RNA نى ئالاھىدە ھىدرولىزلىيالايدۇ.RNase H فوسفوسېستېر باغلىنىشنى يەككە ياكى قوش لىنىيىلىك DNA ياكى RNA دىكى گىدرولىزلىيالمايدۇ ، يەنى ئۇ بىر تال ياكى قوش لىنىيىلىك DNA ياكى RNA نى ھەزىم قىلالمايدۇ.ئادەتتە CDNA نىڭ ئىككىنچى سېپىنىڭ بىرىكىشىدە ئىشلىتىلىدۇ.
بۇ بىر غەلىتە ئىش.بىز تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ RNase H پائالىيىتى بار دەيمىز ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىدا RNase H بار ئەمەس ، RNase H نى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشتىن ئايرىش مۇمكىن ئەمەس ، بەلكىم بەزى گۇرۇپپىلارنىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش شەكلىدىكى ئۆزگىرىشى سەۋەبىدىن بۇ پائالىيەت تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن كېلىپ چىققان بولۇشى مۇمكىن.
شۇڭلاشقا ، AMV نىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى تېخىمۇ يۇقىرى بولۇشىدىن قەتئىينەزەر ، ئۇنىڭ RNase H پائالىيىتى cDNA نىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى تۆۋەنلىتىدۇ.ئەلۋەتتە ، رېئاكتىپ ئىشلەپچىقارغۇچىلار مەھسۇلاتلىرىنى توختىماي ئەلالاشتۇرۇپ ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNase H پائالىيىتىنى ئىمكانقەدەر چىقىرىپ تاشلاپ ، cDNA نىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرىدۇ.
Annealing temperature
ئوخشىمىغان تېمپېراتۇرىدا RNA نىڭ ئىككىنچى قۇرۇلمىسى
ئوخشىمىغان تېمپېراتۇرىدا RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنىڭ ئۈستىدىكى رەسىمگە قاراڭ ، ھەمدە mFold تور قورالىدىن پايدىلىنىپ ، ئالاھىدە تېمپېراتۇرا ۋە تۇز قويۇقلۇقى شارائىتىدا نىشان بۆلەكنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى ئېنىقلاڭ.55 سېلسىيە گرادۇستا ، RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسى يەنىلا ئىنتايىن مۇرەككەپ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئىشلىمەيدۇ ، ئىككىلەمچى قۇرۇلمىنى ° C 65 قا قەدەر تولۇق ھەل قىلغىلى بولمايدۇ ، ھالبۇكى AMV ۋە M-MLV نىڭ ئەڭ ياخشى تېمپېراتۇرىسى بۇ تېمپېراتۇرادىن خېلىلا تۆۋەن.
نېمە قىلىش كېرەك؟ئىككىلەمچى قۇرۇلما قېلىپنىڭ ئۆزى بىر-بىرىنى تولۇقلاش بولۇپ ، دەسلەپكى ۋە تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىسى بىلەن قېلىپ ئوتتۇرىسىدا كۈچلۈك رىقابەت پەيدا قىلىدۇ ، نەتىجىدە E تۆۋەن بولۇش ۋە تەكرارلىنىش ياخشى بولماسلىق قاتارلىق بىر قاتار مەسىلىلەر كېلىپ چىقىدۇ.
نېمە قىلىش كېرەك؟پەقەت ئىمكانقەدەر تېمپېراتۇرىنى ئۆرلىتىڭ.
نۇرغۇنلىغان رېئاكتىپ ئىشلەپچىقارغۇچىلار گېن قۇرۇلۇشى ئارقىلىق تەتۈر كۆچۈرۈلمىسىنى ياخشىلىماقتا.بەزىلىرى جىفان ۋە ئايدەلايغا ئوخشاش ئىنكاس تېمپېراتۇرىسىنى ئۆرلىتىدۇ ، بەزىلىرى ئاكتىپ بولغان RNase H ئېنزىمنى چىقىرىپ تاشلاپ ، ئېنزىم بىلەن RNA قېلىپىنىڭ يېقىنلىقىنى ياخشىلايدۇ.يۇقىرى يېقىنلىق رىقابەت كۈچى بىلەن ئىككىلەمچى قۇرۇلمىنى سىقىپ ئوڭۇشلۇق ئوقۇيالايدۇ ، شۇنداقلا تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمىنى زور دەرىجىدە ئۆستۈرىدۇ.
مۇھىم نۇقتا: تەتۈر ترانسكرىپسىيەنىڭ تەتۈر ترانسكرىپسىيە ئۈنۈمىنىڭ ئىزچىللىقىنى قوغلىشىش تېخىمۇ مۇھىم (فېرمېنتلار ئۈنۈملۈك بولۇپلا قالماي ، يەنە مۇقىم بولۇشى كېرەك) ، يۈكلەنگەن ئەۋرىشكە مىقدارىغا ئەمەس ، ئەگەر ئالاھىدە چوڭ تىپتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR بولمىسا ، ئۇ ھەرگىز مۇمكىن ئەمەس.Multiple cDNAs.
ھەر خىل ئىشلەپچىقارغۇچىلارمۇ ئىزچىللىقنى قوغلىشىش ئۈچۈن بەزى تىرىشچانلىقلارنى كۆرسەتتى.مەسىلەن ، كۆپىنچە شىركەتلەر تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى سېتىلىدىغان ئۆلچەملىك يۈرۈشلۈك زاپچاس سۈپىتىدە ئوراپ بولدى ، بۇ بىر ياخشى تاللاش.
مەسىلەن ، Foregene نىڭ RT Easy يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرى:
RT Easy I (بىرىنچى قاتاردىكى cDNA بىرىكمە زاپچاسنىڭ ئۇستازى)
MIQE (5) - نىشانلىق گېن ئۇچۇرى
يۇقارقى رەسىم چۈشەندۈردى
1. بۇ گېننىڭ قايتا-قايتا سىناق قىلىش ئۈچۈن ئۈنۈملۈك ياكى ئەمەسلىكىنى ئادەتتە قايتا-قايتا سىناق قىلىش ئارقىلىق تەكشۈرگىلى بولىدۇ.
2. گېن كىملىكى ، بىلەمسىز.
3. گېن ئۇزۇنلۇقى ، نىشان گېننىڭ ئومۇمىي ئۇزۇنلۇقى ئەلۋەتتە مەسىلە ئەمەس.پىرىمېر لايىھىلىگەندە ئامپلوننىڭ ئۇزۇنلۇقى 80-200bp ئارىلىقىدا بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىپ ، تېخىمۇ ياخشى كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە كاپالەتلىك قىلىڭ.
4. تەرتىپلىك پارتىلاشنى سېلىشتۇرۇش ئۇچۇرى ، نىشانلىق گېننى گېن بانكىسىدا سېلىشتۇرۇپ ، كونكرېت كېڭەيتىشنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.
5. ساختا كېسەلنىڭ بولۇشى.ساختا گېن نورمال گېنغا ئوخشاش DNA تەرتىپى ، ئەمما نورمال ئىقتىدارىنى يوقىتىدۇ.ئۇ دائىم ئېۋكارىئوتنىڭ كۆپ گېن ئائىلىسىدە مەۋجۇت.ئۇ ئادەتتە represented ئارقىلىق ئىپادىلىنىدۇ.ئۇ گېن گۇرۇپپىسىدىكى ئىقتىدارسىز گېن گۇرۇپپىسىنىڭ كۆپەيتىلگەن نۇسخىسى بولۇپ ، كودلاش گېن تەرتىپىگە ناھايىتى ئوخشايدۇ.، ئادەتتە كۆچۈرۈلمەيدۇ ، ھەمدە ئېنىق فىزىئولوگىيىلىك مەنىسى يوق.
6. پىرىمېرلارنىڭ تاشقى ۋە ئىچكى ئەزالارغا سېلىشتۇرغاندا ئورنى.دەسلەپكى يىللاردا ، بىز DNA نىڭ بۇلغىنىش مەسىلىسىنى ھەل قىلغىنىمىزدا ، بىز دائىم ئىپتىدائىي ، تاشقى قاپارتما ۋە ئىچكى ئەزالارنىڭ ئورنىغا دىققەت قىلاتتۇق ، ئادەتتە DNA نىڭ كېڭىيىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، ئىچكى قىسىمدا پىرىمېر لايىھىلەشنى ئويلىدۇق.تۆۋەندىكى رەسىمنى كۆرۈڭ: قارا رەڭ ئىچكى ئەزالارغا ، ھەر خىل كۆك رەڭلەر تاشقى كۆرۈنۈشكە ، ھالرەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان پىرىمېرلارغا ، ئوچۇق قىزىل بولسا ئۆز-ئارا ئايلانما پىرىسلارغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.
سىخېما ، ھەرگىز توغرا ئەمەس
بۇ نېمىدېگەن مۇكەممەل پىلاندەك قىلىدۇ ، ئەمما ئەمەلىيەتتە ، كۆپىنچە ئەھۋاللاردا ، ئۆز-ئارا ھالقىغان پىرىمېرلار تەسەۋۋۇردىكىدەك سېھىرلىك ئەمەس ، ئۇلار يەنە كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.شۇڭا DNA نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىشنىڭ ئەڭ ياخشى ئۇسۇلى DNA نى پۈتۈنلەي يوقىتىش.
7. ئۆزگەرتىش مۆلچەرى.بۇ مىسالنى قايتا ئىشلىتىپ ، mFold تور قورالىدىن پايدىلىنىپ ، مەلۇم بىر تېمپېراتۇرا ۋە تۇز قويۇقلۇقىدىكى نىشان بۆلەكنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلمىسىنى ئېنىقلاڭ.
ئوخشىمىغان تېمپېراتۇرىدا RNA نىڭ ئىككىنچى قۇرۇلمىسى
ئىككىلەمچى قۇرۇلما قېلىپنىڭ ئۆزى بىر-بىرىنى تولۇقلايدىغان جۈپلىشىش بولۇپ ، ئۇ باشلانغۇچ بىلەن قېلىپنى جۈپلەشتۈرۈش ئوتتۇرىسىدا كۈچلۈك رىقابەتنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، دەسلەپكى باغلاش ئېھتىماللىقى تۆۋەنرەك بولىدۇ ، نەتىجىدە E تۆۋەن بولۇش ۋە قايتا-قايتا تەكرارلىنىش قاتارلىق بىر قاتار مەسىلىلەر كېلىپ چىقىدۇ.يۇمشاق دېتالنى ئالدىن پەرەز قىلىش ئارقىلىق ، ئەگەر ئىككىنچى دەرىجىلىك قۇرۇلما مەسىلىسى بولمىسا ، بۇ بەك ياخشى بولاتتى.ئەگەر بار بولسا ، كېيىنكى ماقالىمىزدا بۇ مەسىلىنى قانداق ھەل قىلىش توغرىسىدا مەخسۇس مۇلاھىزە يۈرگۈزۈلىدۇ.
MIQE (6) —qPCR Oligonucleotides
فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR غا نىسبەتەن ، سىز ھەر كۈنى بىرىنچى بولۇپ كۈرەش قىلىدىغىنىڭىز RNA ئېلىش ، ئىككىنچى ئىش دەسلەپكى لايىھە بولۇشى مۇمكىن.
ئالدى بىلەن ، بىز يەنىلا MIQE تەكشۈرۈش تىزىملىكى بويىچە دەسلەپكى لايىھىلەش توغرىسىدىكى قائىدىلەرنى تەكشۈرۈپ تۇرىمىز.ئەخلەتلەر كۈلەلەيدىغان دەرىجىدە ئاددىي ، بىز ئۇنى بىر جۈملە بىلەن تاماملىيالايمىز: دەسلەپكى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ تەرتىپى ۋە ئورنىنى ۋە ئۆزگەرتىش ئۇسۇلىنى تېپىپ چىقىڭ.دەسلەپكى تازىلاش ئۇسۇلىغا نىسبەتەن ، دەسلەپكى قەدەمدە بىرىكتۈرۈش بەك ئەرزان ، qPCR PAGE ۋە ئۇنىڭدىن يۇقىرى تازىلاش ئۇسۇللىرىغا ئەرزىيدۇ ، بىرىكمە ئەسۋابنىڭ ئۇچۇرى مۇھىم ئەمەس.نۇرغۇن كىشىلەر نەچچە ئون يىلدىن بۇيان پىرىمېر بىلەن شۇغۇللىنىپ ، بىرىكمە دېتالنىڭ ABI3900 ئىكەنلىكىنى بىلمەيدۇ.
دەسلەپكى لايىھىلەش پرىنسىپىغا كەلسەك ، ئۇلارنى ئەستە تۇتۇش ئارقىلىق ئەستە ساقلىشىڭىزنىڭ ھاجىتى يوق ، چۈنكى كۆپىنچە دەسلەپكى لايىھىلەش يۇمشاق دېتالى ياكى تور قوراللىرى بۇ مەسىلىلەرنى ھەل قىلالايدۇ (تەۋسىيە قىلىنغان تور قورالى primer3.ut.ee/) ،% 99.999 دەسلەپكى لايىھىلەش قولدا ئىشلەنمەيدۇ قاراڭ ، ئاپتور بەزىدە كۈندە نەچچە يۈز پىرىمېرنى لايىھىلەيدۇ ، ئەگەر بىر-بىرلەپ ئوقۇسىڭىز ، ئۇ كۆز-كۆز بولۇپ قالىدۇ.
پىرىمېرلار لايىھەلەنگەندىن كېيىن تۆۋەندىكى نۇقتىلارنى تەكشۈرۈپ بېقىڭ:
1. لايىھىلەش ′ 3 ′ ئاخىرىغا يېقىن: ئولىگو dT پىرىسلىغۇچنى cDNA بىرىنچى لىنىيىلىك بىرىكتۈرۈشتە ئىشلەتكەندە ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈنۈمى ۋە RNA پۈتۈنلۈكىنى كۆزدە تۇتۇپ ، لايىھىلەنگەن پىرىسلارنى كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمىنى يۇقىرى كۆتۈرۈش ئۈچۈن 3 ′ ئاخىرىغا يېقىن لايىھىلەش كېرەك.رەسىمنى تۆۋەندىكىدەك چۈشەندۈرۈڭ (بۇنى چۈشىنىشكە ئامال يوق):
پىرىمېرلار نېمىشقا 3 ′ ئاخىرىغا يېقىن لايىھەلەنگەن بولۇشى كېرەك ، ئۇ چوقۇم توغرا بولماسلىقى كېرەك
2. TM قىممىتى: Tm قىممىتى 55-65 سېلسىيە گرادۇس (چۈنكى تاشقى كۆرۈنۈش پائالىيىتى ئەڭ يۇقىرى بولغاندا 60 سېلسىيە گرادۇس) ، GC مەزمۇنى بولسا% 40-% 60.
3. پارتلاش: گېننىڭ ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىلىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، چوقۇم قوشۇمچە دەلىللەش ئۈچۈن Blast ئىشلىتىش كېرەك.
MIQE (7) —qPCR جەريان
1. qPCR يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرى
MIQE نىڭ تەلىپىگە ئاساسەن ، بىز ماقالىدىكى PCR ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ سەپلىمىسى ، قانداق زاپچاس ئىشلىتىلگەنلىكى ، ئىشلەپچىقارغۇچى كىم ، ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ قانچىلىك چوڭلىقى ، بوياش ئۇسۇلى ياكى تەكشۈرۈش ئۇسۇلى قوللىنىلغانلىقى ، PCR پروگرامما تەڭشىكىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان تولۇق ئىنكاس شارائىتىنى ئېنىق تەسۋىرلىشىمىز كېرەك.پېشقەدەم شوپۇرلار جەزمەن بۇ زاپچاسنى تاللىسىلا ، يۇقىرىدىكى ئۇچۇرلارنىڭ ئاساسەن بېكىتىلگەنلىكىنى بايقايدۇ.
ھازىر ، فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR زاپچاسلىرىنى ئىشلەپچىقىرىش ۋە ئىشلەپچىقىرىش ئىنتايىن پىشقان تېخنىكا.پەۋقۇلئاددە ناچار ئىشلەپچىقارغۇچىلارنى تاللىمىسىڭىز ، مەسىلىلەرنىڭ يۈز بېرىش ئېھتىماللىقى يۇقىرى ئەمەس ، ئەمما بىز يەنىلا سىز بىلەن بىر قانچە نۇقتىنى ئورتاقلىشىشنى خالايمىز:
قىزىق قوزغىتىش تاق ئېنزىم:PCR نىڭ ئەڭ مۇھىم يېرى قىزىق قوزغىتىش Taq ئېنزىم.بازاردىكى قىزىق باشلىنىش فېرمېنتى ئادەتتە ئىككى خىلغا بۆلىنىدۇ ، بىرى خىمىيىلىك ئۆزگەرتىلگەن قىزىق باشلىنىش ئېنزىم (ئۇنى پارافىن قىستۇرمىسى دەپ تەسەۋۋۇر قىلالايسىز) ، يەنە بىرى ئانتىتېلانى ئۆزگەرتىش (ئانتىگېن ئانتىتېلاسىنى باغلاش).خىمىيىلىك ئۆزگەرتىش قىزىق قوزغىتىش ئېنزىمنىڭ دەسلەپكى ئۇسۇلى.مەلۇم تېمپېراتۇرىغا يەتكەندە ، ئېنزىم پائالىيىتىنى قويۇپ بېرىدۇ.ئانتىتېلا ئۆزگەرتىلگەن ئىسسىق باشلىنىش ئېنزىم بىئولوگىيىلىك ئۇسۇللارنى ئىشلىتىپ فېرمېنتنىڭ پائالىيىتىنى توسىدۇ.مەلۇم تېمپېراتۇرىغا يەتكەندە ، ئانتىتېلا ئاقسىل سۈپىتىدە ھەرىكەتلەندۈرۈلۈپ ئاكتىپسىزلىنىدۇ ۋە فېرمېنت پائالىيىتى ئېلىپ بېرىلىدۇ.
قانداقلا بولمىسۇن ، بۇنىڭ نېمە پايدىسى بار؟بۇ خىل ئەھۋال ، ئانتىتېلا ئۆزگەرتىلگەن فېرمېنتلارنىڭ قويۇپ بېرىش پائالىيىتى خىمىيىلىك ئۆزگەرتىلگەن فېرمېنتلارنىڭكىدىن تېز بولىدۇ ، شۇڭا سەزگۈرلۈك جەھەتتە ، ئانتىتېلا ئۆزگەرتىلگەن فېرمېنتلارنىڭ ئازراق ئەۋزەللىكى بار ، شۇڭا بازاردىكى زاپچاسلاردا خىمىيىلىك ئۆزگەرتىلگەن فېرمېنت ئاساسەن يوق.ئەگەر بار بولسا ، ئۇنداقتا بۇ ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ تېخنىكىسى يەنىلا مىڭ يىللىق دەۋردە توختاپ قالدى.
ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى:PCR ئىنكاسىدا ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى ئىنتايىن مۇھىم.مۇۋاپىق ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى تاك فېرمېنتى پائالىيىتىنىڭ تارقىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ.ئەگەر قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا ، ئېنزىم پائالىيىتى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەيدۇ.ئەگەر قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى بولسا ، ئېنزىم كاتالىزلانغان ئالاھىدە بولمىغان كۈچەيتىش كۈچىيىدۇ.ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى پىرىمېرلارنىڭ ئۇلىنىشى ، قېلىپ ۋە PCR مەھسۇلاتلىرىنىڭ ئېرىش تېمپېراتۇرىسىغىمۇ تەسىر كۆرسىتىپ ، كۈچەيتىلگەن پارچىلارنىڭ مەھسۇلات مىقدارىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ.ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى ئادەتتە 25mM دە كونترول قىلىنىدۇ.ئەلۋەتتە ، ياخشى يۈرۈشلۈك زاپچاس ئۈچۈن ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقىنى ياخشى كونترول قىلىش كېرەك.بەزى سودىگەرلەر رېئاكتورغا ماگنىي ئىئون خىلىتلاش دورىسى قوشۇپ ، ماگنىي ئىئوننىڭ قويۇقلۇقىنى ئاپتوماتىك تەڭشەش ئۈنۈمىگە ئېرىشەلەيدۇ.
فلۇئورېسسېنسىيە بوياق قويۇقلۇقى:بىز ئادەتتە ئىشلىتىدىغان SYBR يېشىل رەڭدىكى فلۇئورېسسېن بوياش ئاساسلىقى قوش لىنىيىلىك DNA نىڭ كىچىك ئۆستەڭگە باغلاش ئارقىلىق فلۇئورېسسېنسىيە ھاسىل قىلىدۇ ، چۈنكى بوياقنىڭ قوش لىنىيىلىك DNA بىلەن باغلىنىشى كونكرېت ئەمەس ، يەنى قوش سىزىقلىق DNA ئۇنىڭ بىلەن بىرلەشتۈرۈلسىلا ، فلۇئورېسسېنسىيە پەيدا بولىدۇ ، شۇڭا سىستېمىدىكى دەسلەپكى ئۆلچەم ۋە DNA قېلىپى شەكىللىنىدۇ.
PS: نۇرغا سەزگۈر خۇسۇسىيىتى بولغاچقا ، بازاردىكى مەھسۇلاتلار ئادەتتە قوڭۇر رەڭلىك سۈزۈك مەركەزدىن ياسالغان تۇرۇبىغا قاچىلانغان (تۆۋەندىكى رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك).قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ بىر مەسىلىگە دۇچ كېلىدۇ.ئەۋرىشكە ئالغاندا سۇيۇقلۇقنىڭ سۈمۈرۈلگەن ياكى قىلىنمىغانلىقىنى كۆرۈش تەس.بۇ نۇقتىدىن ئېيتقاندا ، چىڭكې ھەقىقەتەن ئابونتلارغا ئەڭ قۇلايلىق (تۆۋەندىكى رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك) ، سۈزۈك تۇرۇبا ئوچۇق قەلەي خالتىغا قاچىلانغان.ئاندىن نۇر ۋە ئەۋرىشكە ئېلىشتىن ساقلىنىشنىڭ قۇلايلىقىنى كۆزدە تۇتۇپ ، ئۇنى قەلەي خالتىغا سېلىڭ.مۇۋاپىق مەھسۇلات نومۇرىنى تاللىشىڭىز كېرەك.TSE204 دەرىجىدىن تاشقىرى تېجەشلىك مەۋجۇتلۇق ، ئۇ مېنى ئوت-چۆپ تېرىشنى ئارزۇ قىلىدۇ.
فلۇئورېسسېنسىيە بوياقنىڭ قويۇقلۇقىمۇ ئىنتايىن مۇھىم.ئەگەر قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا ، كۈچەيتىش ئەگرى سىزىقى كېيىنكى باسقۇچتا ئۆرلىمەيدۇ ۋە مۇكەممەل بولمايدۇ.ئەگەر قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى بولسا ، شاۋقۇنغا دەخلى قىلىدۇ.فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR ئاساسلىقى CT قىممىتىگە باغلىق بولغاچقا ، ئەگەر فلۇئورېسسېن بوياقنىڭ قويۇقلۇقى مۇۋاپىق تەڭشەلمىسە ، تۆۋەن نۇقتا يۇقىرى نۇقتىدىن ياخشى.ئەلۋەتتە ، مۇۋاپىق بوياق قويۇقلۇقى ئەڭ ياخشى.
ROX: ROX بوياقلىرى قۇدۇقتىن فلۇئورېسسېنسىيە سىگنال خاتالىقىنى تۈزىتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.بەزى چالغۇ ئىشلەپچىقارغۇچىلار تەڭشەشنى تەلەپ قىلىدۇ ، بەزىلىرى تەلەپ قىلمايدۇ.مەسىلەن ، تېرمو فىشېر ئىلمىي شىركىتىنىڭ ھەقىقىي ۋاقىت PCR كۈچەيتمە ئەسۋابىنى ئىشلىتىش ئادەتتە تەڭشەشنى تەلەپ قىلىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە 7300 ، 7500 ، 7500Fast ، StepOnePlus قاتارلىقلار بار. ئادەتتىكى يۈرۈشلۈك كۆرسەتمىلەر ئۇنى تەسۋىرلەيدۇ.
Foregene نىڭ qPCR ئارىلاشمىسىدا يەنە ROX بوياق بار ، ئۇ ھەر خىل تىپلاردا ئىشلىتىشكە قۇلايلىق.
ئاجىز ھىدروگېن زايومىنى داۋالاش: ئاجىز ھىدروگېن زايومىنى داۋالاش بىر قەدەر تېخنىكىلىق مەسىلە.نۇرغۇن زاپچاسلارنىڭ قوللانمىسىنى ھېچ نەرسە ئوقۇمىغان ، ئەمما ھېچقايسىسى بۇ تېمىنى تىلغا ئالمىغان.ئەمەلىيەتتە ، ئۇ ئىنتايىن مۇھىم.ئاساسلارنىڭ بىرىكىشى ئاساسلىقى ھىدروگېن زايومىنىڭ كۈچلۈكلۈكىگە باغلىق.كۈچلۈك ھىدروگېن زايومى نورمال كۈچەيتىلىدۇ ، ئاجىز ھىدروگېن رىشتىسى كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئەگەر ئاجىز ھىدروگېن زايومىنى ياخشى تۈگەتكىلى بولمىسا ، كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىشتىن ساقلانغىلى بولمايدۇ.ئاپتور دائىرىسىدە ، پەقەت بىر قانچە شىركەتلا بۇ مەسىلىنى بايقىغان.بۇ زاپچاسنى سېتىۋالغاندا ، سىز تاللىماقچى بولغان يۈرۈشلۈك دېتالغا قارىتا بۇ جەھەتتە ھەل قىلىش چارىسىنى ئويلاشقان ياكى كۆرمىگەنلىكىڭىزنى كۆرسەتسىڭىز بولىدۇ.
ئىنكاس مىقدارى: 20-50ul سىستېمىسى تېخىمۇ كۆپ ئىشلىتىلىدۇ ، كىچىك ھەجىمدە خاتالىق كېلىپ چىقىشى مۇمكىن.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، يۈرۈشلۈك كۆرسەتمىلەر PCR رېئاكسىيە مىقدارىنى ئىشلىتىشنى تەۋسىيە قىلىدۇ.ئەقىللىق بولماڭ ھەمدە تەننەرخنى تېجەش ئۈچۈن كىچىك ھەجىم ئىشلىتىڭ.نىشان.سودىگەرلەر تەۋسىيە قىلغان ھەجىم ئەمەلىيەتتە سىناق قىلىنغان ، بەلكىم ئۇلار كىچىك ھەجىم كەلتۈرۈپ چىقارغان خاتالىق مەسىلىسىنى ھەل قىلالماسلىقى مۇمكىن.
2. تۇرۇبا تاختىسىنى ئىشلەپچىقارغۇچى ۋە ماقالە نومۇرى
فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR پرىنسىپىنى ھەممە ئادەم بىلىدۇ.فلۇئورېسسېنسىيە توپلاش ئاساسلىقى PCR تۇرۇبا دوپپىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىدۇ.PCR ئىستېمال بۇيۇملىرىنى تاللىغاندا ، يورۇقلۇق يەتكۈزۈش ۋە ئەسۋابقا ماس كېلىدىغان ئىككى نۇقتىغا دىققەت قىلىڭ.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، ئاساسلىق ماركىلارنىڭ تاختىلىرى ۋە تۇرۇبىلىرى ياخشى ، ئەمما ماسلىشىش جەھەتتە ئەستايىدىل تاللىشىڭىز كېرەك ، بولمىسا بۇ ئەسۋابنى ئىشلىتەلمەيسىز.
4. يۇقىرى دەرىجىلىك بىلىملەر
MIQE (8) —qPCR دەلىللەش
بۇ qPCR نىڭ ئەڭ مۇھىم ئىشى!نۇرغۇن قەھرىمانلار بۇ يەردىكى قۇمغا چۈشۈپ كەتتى.ئەلۋەتتە ، سىزنىڭ تەلىيىڭىز بولۇشى مۇمكىن ، سىز ئۆگەنگەن گېنلار ئاددىي ، شۇڭا سىز مۇز ئۆڭكۈرىدە شامالنى بويلاپ لەيلەپ قالدىڭىز.QPCR نىڭ دەلىللەش ئۇچۇرى سانلىق مەلۇماتلارنىڭ ئىشەنچلىكلىكىنى سىناشنى مەقسەت قىلىدۇ.زۆرۈر دەلىللەش ئۇچۇرلىرىنى تۆۋەندىكىدەك تىزىمىز:
1. ئېنىقلىق سىنىقى
نىشانلىق گېننى كۈچەيتىشنىڭ كونكرېتلىقى ئېلېكتروفورېز رەسىمىنىڭ يەككە بەلۋاغ ياكى ئەمەسلىكىنى تەكشۈرۈش ئارقىلىق سىناق قىلىنىدۇ.تەرتىپنى دەلىللەشئەگرى سىزىقنىڭ چوققا خەرىتىسىنىڭ يەككە ياكى ئەمەسلىكىنى بىلىشئېنزىم ھەزىم قىلىشنى تەكشۈرۈش ۋە باشقا ئۇسۇللار.
بۇ يەردە بىز تئۇ ئەگرى ئېرىتىش ئۇسۇلى ئارقىلىق كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىشنى تەھلىل قىلدى.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، پىرىمېر لايىھىلىگەندە ، مەھسۇلات پارچىسىنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى 80-200bp ئارىلىقىدا بولۇشى تەلەپ قىلىنىدۇ ، بۇ PCR مەھسۇلاتىنىڭ ئېرىتىش تېمپېراتۇرىسىنى 80-85 ° C ئارىلىقىدا قىلىدۇ.شۇڭلاشقا ، ئەگەر ئوخشىمىغان چوققىلار بولسا ، چوقۇم باشقا ئالاھىدە بولمىغان كۈچەيتمە مەھسۇلاتلار بولۇشى كېرەك.ئەگەر يۇقىرى تېمپېراتۇرا ° C 80 تىن تۆۋەن بولسا ، ئادەتتە ئۇ دەسلەپكى ۋاقىت ھېسابلىنىدۇ.ئەگەر يۇقىرى تېمپېراتۇرا ° C 85 تىن يۇقىرى بولسا ، ئادەتتە DNA نىڭ بۇلغىنىشى ياكى چوڭ پارچىلىرىنىڭ تېخىمۇ مۇھىم بولمىغان كۈچەيتىلىشى دەپ قارىلىدۇ.
ئەسكەرتىش: بەزىدە 80 سېلسىيە گرادۇستا پەقەت بىرلا چوققا بولىدۇ.بۇ ۋاقىتتا ، بۇ ئۇقۇمدا چىڭ تۇرۇش كېرەك.كۈچەيتىش نەتىجىسىنىڭ ھەممىسى دەسلەپكى ئۆلچەم بولۇشى مۇمكىن.
نورمال ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى (ئالاھىدە چوققىسى يوق يەككە چوققا)
مەسىلە بار ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى (ساختا چوققىلارنىڭ كونكرېت كۈچەيتىلىشى)
【Case analysis】
ئاساسلىق چوققا بار ، ئەمما دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ ئېغىر
تۆۋەندىكى رەسىمدىكى يەككە چوققا ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى كۆزنى ئاسانلا ئالدايدۇ ، ئۇنى مۇكەممەل تەجرىبە دەپ ئويلايدۇ ، ئەمما نەتىجىسى پۈتۈنلەي خاتا.بۇ ۋاقىتتا بىز ئېرىگەن تېمپېراتۇرىغا قارىشىمىز كېرەك.چوققا تېمپېراتۇرىسى ° C 80 تىن تۆۋەن بولۇپ ، پۈتۈنلەي پىرىسلانغان.
نىشان بۆلەك يوق ، بارلىق دەسلەپكى ۋاقىت ئۆلچىمى
بۇ يەردە ئاكام توختاپ قالمايدۇ.تۆۋەندىكى رەسىم يان تېلېفون بىلەن تارتىلغان سۈرەت.ئۇ ئىشلەتكەن رېئاكتورلارنىڭ ھەممىسى بۇ ساھەدە كۆپ ئىشلىتىلىدىغان ماركا.ئۇ بىر T-prefix ماركىسىدىن يەنە بىر T-prefix ماركىسىغا ئۆزگەردى.مېنىڭچە ئۇنى ئاللىقاچان پەرەز قىلىپ بولدىڭىز.ئەخلەت ساندۇقى ماڭا ۋارقىراپ: «بىرىنچى رەسىمدە ئىشلىتىلگەن رېئاكتور بەك ياخشى ، چوققىسى يەككە.كېيىن ، سىز تەۋسىيە قىلغان رېئاكتورنى ئىشلىتىپ بولغاندىن كېيىن ، ئۇ ئىككىنچى رەسىمگە ئوخشايدۇ ، ئارىلاش چوققىلار بار.سەن مېنى بىئارام قىلدىڭ.«
ئىككى گرافىكنى ئايرىڭ.بىر قاراشتىلا ، بىرىنىڭ چوققىسى ، يەنە بىرىنىڭ قوش چوققىسى بار.قۇرۇق گەپ ، يەككە چوققا ئەلۋەتتە ياخشى.بۇ راستمۇ؟
Dou E دىنمۇ ناچار يېرى ، مەن بۇ ئىككى رەسىمنى تۆۋەندىكى رەسىمگە قويسام ، دەرھال چۈشىنىسىز.ئەمەلىيەتتە ، بىز بۇ خىل رەسىمدىن ئاسانلا پالەچ بولۇپ قالىمىز.ئەستايىدىللىق بىلەن تەھلىل قىلغاندىن كېيىن ، شۇنى بايقىدۇق: بىرىنچى رەسىمنىڭ چوققىسى ° C 75 قا يېتىدۇ ، بۇ پۈتۈنلەي دەسلەپكى ۋاقىت.ئىككىنچى رەسىمنىڭ چوققىسى ° C 75 ۋە ° C 82 ، ھېچ بولمىغاندا بۇ يەردە مەھسۇلات پەيدا بولىدۇ.
ئوقۇغۇچىلارنىڭ تەكلىپ-پىكىرلىرى
شۇڭا نېگىزلىك مەسىلە رېئاكتور مەسىلىسى ئەمەس ، بەلكى دەسلەپكى لايىھىلەش مەسىلىسى.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، ئۇ يەنە بەزى چوڭ ماركىلارنىڭ تۆمۈر سۈپىتىنىڭ يوقلىقىنى ئىسپاتلايدۇ ، شۇنداقلا ئۇ ئاكامنىڭ ئىلگىرى ئېيتقانلىرىنى ئىسپاتلايدۇ: ماقالىڭىزنى قوللايدىغان رېئاكتىپ ماركا ئەمەس.بۇ ماقالىڭىز رېئاكتورنىڭ ماركىسىنى قوللىغان.تەسەۋۋۇر قىلىپ بېقىڭ ، ئەگەر ئەخلەت رېئاكتورنى ئۆزگەرتمىسە ، خاتا سانلىق مەلۇمات ژۇرنالغا ئەۋەتىلىدۇ ، نېمە ئىش يۈز بېرىدۇ پاجىئە بولىدۇ.
2. قۇرۇق كونترولنىڭ Ct قىممىتى
چۈشەندۈرمەڭ ، ئەگەر قۇرۇق كونترولنىڭ Ct قىممىتى بولسا ، ئۇ بۇلغىنىش ئەمەسمۇ؟قانداقلا بولمىسۇن ، سىز يەنىلا قايسى قۇرۇق كونترولنىڭ Ct قىممىتى بارلىقىنى چۈشىنىشىڭىز كېرەك.ئەگەر ئۇ NTC بولسا ، رېئاكتىپ بۇلغىنىش قاتارلىق چەتئەل DNA نىڭ بارلىقىنى بىلدۈرىدۇ.ئەگەر ئۇ NRT بولسا ، ئېلىنغان RNA نىڭ DNA بۇلغىنىشىدىن دېرەك بېرىدۇ.
3. ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق
يانتۇلۇق ۋە ھېسابلاش فورمۇلاسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغاندا ، PCR ئۈنۈمىنى فورمۇلا ئارقىلىق ھېسابلىغىلى بولىدۇ.مۇكەممەل تەجرىبە ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنىڭ يانتۇلۇقنىڭ 3.32 گە ، R² نىڭ 0.9999 غا يېقىنلىشىشىنى تەلەپ قىلىدۇ.
4. سىزىقلىق ھەرىكەتچان دائىرە
ئىنكاسنىڭ ھەرىكەتچان دائىرىسى تۈز بولىدۇ.ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلىشتا قوللىنىلغان قېلىپقا ئاساسەن ، ھەرىكەتچان دائىرە كەم دېگەندە 5 قويۇقلۇق دەرىجىسىنى ئۆز ئىچىگە ئېلىشى ھەمدە يۇقىرى قويۇقلۇق دەرىجىسى ۋە تۆۋەن قويۇقلۇق دەرىجىسىدىكى Ct قىممىتىنىڭ ئۆزگىرىشىگە دىققەت قىلىشى كېرەك.
5. بايقاشنىڭ توغرىلىقى
QPCR نەتىجىسىنىڭ ئۆزگىرىشى ، يەنى تەكرارلىنىشنىڭ ياخشى بولماسلىقى ، يەنى ئېنىقلىقنىڭ ياخشى بولماسلىقى تېمپېراتۇرا ، قويۇقلۇقى ۋە مەشغۇلات قاتارلىق نۇرغۇن ئامىللار كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.كۆپەيتىلگەن ساننىڭ ئازىيىشىغا ئەگىشىپ ، qPCR ئېنىقلىقى ئادەتتە كونترول قىلغىلى بولمايدۇ.ئەڭ ياخشىسى تەجرىبە ئىچىدىكى ئۆزگىرىش ، بۇ تېخنىكىلىق ئۆزگىرىش بىئولوگىيىلىك ئۆزگىرىشتىن پەرقلىنىشى كېرەك ، بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىشلەر گۇرۇپپا ياكى داۋالاش ئوتتۇرىسىدىكى qPCR نەتىجىسىدىكى ستاتىستىكىلىق پەرقنى بىۋاسىتە ھەل قىلالايدۇ.بولۇپمۇ دىئاگنوز قويۇشتا ، تور بېكەت ۋە تىجارەتچىلەر ئارىسىدىكى ئەڭ ياخشى ئارىلىق ئارا ئېنىقلىق (تەكرارلىنىش) دوكلات قىلىنىشى كېرەك.
6. بايقاش ئۈنۈمى ۋە LOD (كۆپ ئىقتىدارلىق qPCR دا)
LOD بايقالغان مۇسبەت ئەۋرىشكىنىڭ 95% نىڭ ئەڭ تۆۋەن قويۇقلۇقى.باشقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، بىر يۈرۈش نىشانلىق گېن كۆپەيتىلگەن LOD نىڭ قويۇقلۇقى مەغلۇپ بولغان ئىنكاسلارنىڭ% 5 تىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك.كۆپ ئىقتىدارلىق qPCR تەھلىلى قىلغاندا ، بولۇپمۇ نۇقتا ئۆزگىرىشى ياكى كۆپ مەنبەلىك ئۆزگىرىشنى بىرلا ۋاقىتتا بايقاش ئۈچۈن ، كۆپ ئىقتىدارلىق qPCR ئوخشاش بىر تۇرۇبىدا كۆپ نىشان پارچىلىرىنىڭ توغرىلىقىنىڭ دەخلى-تەرۇزغا ئۇچرىمىغانلىقىنى ، كۆپ خىل بايقاش ۋە يەككە نەيچىنى تەكشۈرۈش ئۈنۈمى ۋە LOD نىڭ ئوخشاش بولۇشى كېرەكلىكىنى ئىسپات بىلەن تەمىنلىشى كېرەك.بولۇپمۇ يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى نىشان گېنى ۋە تۆۋەن قويۇقلۇقتىكى نىشان گېنى بىرلا ۋاقىتتا كۈچەيتىلگەندە ، بۇ مەسىلىگە چوقۇم دىققەت قىلىش كېرەك.
مەسىلە ۋە ھەل قىلىش چارىسىئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، qPCR ھەل قىلىشتا دائىم ئۇچرايدىغان مەسىلىلەر تۆۋەندىكى تەرەپلەرگە مەركەزلەشتى:
· ئەھمىيەتسىز كۈچەيتىش
Prim دەسلەپكى قەدەمدىكى قويۇقلۇقى ۋە قىيىنلىق دەرىجىسىدىكى قىيىنچىلىق
· تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى توغرا ئەمەس
· ئىككىلەمچى قۇرۇلما كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ
ئەھمىيەتسىز كۈچەيتىش
non-specific amplificationيۈز بېرىدۇ ، ئادەتتە دەسلەپكى لايىھەنىڭ ماس كەلمەيدىغان ياكى ماس كەلمەيدىغانلىقى قارىلىدۇ ، ئەمما ئەگەر سىز دەسلەپكى تاللاشنى ئۆزگەرتىشكە ئالدىرىمىسىڭىز ، ئالدى بىلەن تۆۋەندىكى ئۇسۇللارنى سىناپ باقسىڭىز بولىدۇ (پرىنسىپمۇ قوشۇمچە):
تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى ئۆرلىتىش - ئاجىز ھىدروگېن رىشتىنى ساقلاپ قېلىشقا ئۇرۇنۇش.
· تۇتاشتۇرۇش ۋە ئۇزارتىش ۋاقتىنى قىسقارتىش - ئاجىز ھىدروگېن زايومىنىڭ پۇرسىتىنى ئازايتىش.
· دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى ئازايتىش - ئارتۇقچە پىرىس ۋە نىشانسىز رايونلارنىڭ باغلىنىش پۇرسىتىنى ئازايتىش.
تۆۋەن كۈچەيتىش ئۈنۈمى
كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىشنىڭ ئەكسىچە ئەھۋال - تۆۋەن دەرىجىدىكى كۈچەيتكۈچ ئۈنۈمى ، تۆۋەن كۈچەيتمە ئۈنۈمگە تاقابىل تۇرۇش تەدبىرلىرى دەل ئەكسىچە:
· ئۇلاش ۋە ئۇزارتىش ۋاقتىنى ئۇزارتىش ؛
· ئۈچ باسقۇچلۇق PCR غا ئۆزگىرىپ ، قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى تۆۋەنلىتىڭ.
· دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى ئاشۇرۇش.
Ps: 90-يىللاردا تۇغۇلغان نۇرغۇن ئاسپىرانتلار تەجرىبىنى قانداق يېشىشنى ئۆگىنىشنى خالىمايدۇ ، ھەمدە بۇ زاپچاسنىڭ مەسىلىنى تولۇق ھەل قىلىشىنى ئۈمىد قىلىدۇ (ئەگەر سىز رېئاكتور شىركىتىگە بېرىپ ئوقۇش پۈتتۈرگەندىن كېيىن تەتقىقات ۋە تەرەققىياتنى قىلماقچى بولسىڭىز) ، ئەمەلىيەتتە ، رېئاكتىپ ئىشلەپچىقارغۇچىلارمۇ بۇ خىل ئۇسۇلنى ئويلايدۇ ، مەن ئۇنى ئەخمەق دەپ ئويلايمەن ، ئۇنى قوبۇل قىلغاندا ئاجىزلاشتۇرماسلىق ئامىللىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.مەسىلىنى ئاسانلا ھەل قىلىش ئۈچۈن ، ئەخمەقلەر يەنىلا رېئاكتىپ شىركەتنىڭ تونۇشتۇرۇشىنى ئوقۇپ ، ئاجىز ھىدروگېن زايومىنى سۈمۈرۈۋالىدىغان ئامىل بار-يوقلۇقىنى بىلىشى كېرەك.
پىرىمېرنىڭ قويۇقلۇقىنى تاللاش ۋە دەسلەپكى كۆرسەتكۈچلەر بىلەن ئاۋارىچىلىق
ئۇسۇل 1: ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، qPCR نىڭ يۈرۈشلۈك كۆرسەتمىلىرى سىستېمىلارنى تەۋسىيە قىلدى ھەمدە دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى تەۋسىيە قىلدى.
2-ئۇسۇل: دەسلەپكى قويۇقلۇق دەرىجىسىنى تەڭشەش ئارقىلىق ھەل قىلىش.تۆۋەندىكى رەسىم بىر شىركەتتىن ئوغرىلانغان.تۆۋەندىكى رەسىمدە ئۈچ خىل دەسلەپكى قويۇقلۇق دەرىجىسى (100nM ، 250nM ، 500nM) ۋە تۆت قېلىپ قويۇقلۇق دەرىجىسى (0.1ng ، 1ng ، 10ng ، 100ng) بىلەن ياسالغان فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار نەتىجىسى كۆرسىتىلدى.تەجرىبە نەتىجىسىنىڭ Ct قىممىتى تۆۋەندىكىدەك پىلانلانغان:
دەسلەپكى قويۇقلۇقنى تاللاش ھەر بىر دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى بىر قۇرغا بىرلەشتۈرۈڭ:
دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى تاللاش ئېنىق ، 100nM ۋە 250nM لىك دەسلەپكى قويۇقلۇقىنىڭ تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋىتى تېخىمۇ ياخشى ، 500nM نىڭ دەسلەپكى قويۇقلۇقىنىڭ سىزىقلىق مۇناسىۋىتى بىر قەدەر ناچار.100nM ۋە 250nM دە ، Ct قىممىتى 250nM بىر قەدەر كىچىك ، شۇڭا ئەڭ ياخشى دەسلەپكى قويۇقلۇقى 250nM.ئادەتتە قاتتىق ئەگرى سىزىقلارنى ئېرىتىش ئەگرى سىزىقىدا كۆرگىلى بولىدۇ.ئەگەر لايىھىلەنگەن پىرىمېرلار دەسلەپكى ئۆلچەمدىن ساقلىنالمىسا قانداق قىلىش كېرەك؟
3-ئۇسۇل: پىرىمېرنىڭ مىقدارىنى ئازايتىپ ، قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى ئۆرلىتىڭ (چۈشەندۈرۈشنىڭ ھاجىتى يوق).
تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنىڭ تەجرىبە قىممىتى 60 ° C.ئەگەر ئىشەنمىسىڭىز ، تېخىمۇ ماس كېلىدىغان تېمپېراتۇرىنى قانداق تاللاش كېرەك؟بۇنىڭ جاۋابى دەسلەپكى زېھنىنى تاللاش بىلەن ئوخشاش -gradient test.Bio-rad شىركىتىدىن رەسىمگە چۈشۈپ مەسىلىنى چۈشەندۈرۈڭ.مەلۇم بىر نىشان بۆلەكنىڭ كۈچەيتىلىشى ئۈچۈن ، سەككىز تېمپېراتۇرا رېئاكسىيەسىنى تەڭشەڭ ، ھەر بىرىدە ئۈچ قېتىم تەكرارلىنىدۇ ، ئېرىشكەن كۈچەيتىلگەن ئەگرى سىزىق تۆۋەندىكىچە:
تېمپېراتۇرا تاللاش:
· 70 ° C ، 69 ° C - ئاساسەن پىرىمېرلارنى بىرلەشتۈرگىلى بولمايدۇ ، شۇڭا كۈچەيتكىلى بولمايدۇ.
· 67.3 ° C - باشتا ئاز مىقداردا كېڭەيتىش بار ، Ct قىممىتى بىر قەدەر چوڭ.
· 64.5 ° C —— Ct قىممىتى تۆۋەنلەيدۇ.
· 60.7 ° C ، 58.0 ° C ، 56.2 ° C ۋە 55.0 ° C بولغاندا ، Ct قىممىتى ئاساسەن مۇقىم بولۇشقا مايىل بولغان ، ئەمما ئاخىرقى فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى باشقىچە بولغان.
قانداق تاللاش كېرەك؟پرىنسىپ: بىرىنچى پرىنسىپ تېخىمۇ يۇقىرى Ct قىممىتى.ئوخشاش Ct قىممىتى ئۈچۈن ، تېخىمۇ يۇقىرى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى تاللاڭ ، ۋاقىت سىزىقى ۋە ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكتىن ساقلىنىڭ.گەرچە 55 سېلسىيە گرادۇسلۇق يۇقىرى فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتى بولسىمۇ ، ئەمما ئۇنىڭدا ۋاقىت سىزىقى ياكى كونكرېت كۈچەيتمەسلىك بولۇشى مۇمكىن.
ئەگەر سىزدەك ئەقىللىق بولسىڭىز ، چوقۇم ئويلايسىز: لوگىكا جەھەتتىن ئېيتقاندا ، ئەگەر PCR نىڭ ئىنكاسى ئىنتايىن كونكرېت بولسا ، دەسلەپكى قويۇقلۇقى ئەڭ تۆۋەن تەلەپتىن ئېشىپ كەتسىلا ، يۇقىرى ۋە تۆۋەن نۇقتىلارنىڭ ھېچقانداق ئۈنۈمى بولماسلىقى كېرەك ، خۇددى فلۇئورېسسېن بوياق ۋە DNTP غا ئوخشاش.دەرۋەقە ، ئۇلاش تېمپېراتۇرىسى مۇۋاپىق ئەلالاشتۇرۇلسىلا ، دەسلەپكى قويۇقلۇقىنىڭ Ct قىممىتىگە بولغان تەسىرى تەبىئىيلا تۆۋەنلىتىلىدۇ.
تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى مۇۋاپىق ئەلالاشتۇرۇلۇپ ، دەسلەپكى قويۇقلۇقنىڭ CT غا بولغان تەسىرى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈلىدۇ
ئىككىلەمچى قۇرۇلما كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ
بۇ مەسىلىنى چۈشەندۈرۈش ئۈچۈن Bio-rad دىن رەسىمگە ئالايلى.ئۇ يەنە ئىككىلەمچى قۇرۇلمىلىق گېننى كۈچەيتىش ئۈچۈن تېمپېراتۇرا دەرىجىسىنى لايىھىلەيدۇ.
ئىككىلەمچى قۇرۇلما بارلىققا كېلىدۇ
بۇنىڭدىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى ، تېمپېراتۇرا تەدرىجىي تۆۋەنلىگەندە ، مەھسۇلاتلار كۆرۈلۈشكە باشلايدۇ ۋە Ct قىممىتى ئالغا ئىلگىرىلەپ ، ئەڭ تۆۋەن قىممەت 60.7 ° C قا يېتىدۇ ، ئاندىن تېمپېراتۇرا تەدرىجىي تۆۋەنلىگەندە ، Ct قىممىتى چوڭىيىدۇ.ئەكسىچە ، تېمپېراتۇرىنىڭ ئۆرلىشىگە ئەگىشىپ ، ئىككىلەمچى قۇرۇلما ئېچىلىپ ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئاشىدۇ.مەلۇم تېمپېراتۇرىغا يەتكەندىن كېيىن ، تېمپېراتۇرىنى ئاشۇرۇش كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى ئۆستۈرەلمەيدۇ.چۈنكى بۇ ۋاقىتتا پىرىمېرلارنى مۇقىم بىرلەشتۈرگىلى بولمايدۇ.شۇڭلاشقا ،ئەڭ تۆۋەن Ct قىممىتى بىلەن تېمپېراتۇرىنى ئىزدەڭ، ئىككىلەمچى قۇرۇلما قېلىپىنى كۈچەيتىشنىڭ ئەڭ ياخشى تېمپېراتۇرىسى!ئەلۋەتتە ، ئەقىللىق ئەخمەقلەر شۇنى بىلىشى كېرەككى ، ئەگەر زۆرۈر بولمىسا ، ئەڭ ياخشىسى دەسلەپكى تاللاشنى ئۆزگەرتىپ ، ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونىدىن ساقلىنىش كېرەك.
5. ئىلتىماس قىلىش دەرىجىسى
MIQE - سانلىق مەلۇمات ئانالىزى
سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ئاساسلىقى فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR قورالى تەرىپىدىن بېرىلگەن.ئالدىنقى ماقالىدە تەجرىبە لايىھىلەشتە چۈشەندۈرۈلگەن قۇرۇق كونترول قاتارلىق نۇرغۇن سانلىق مەلۇماتلارنى تەھلىل قىلىش خىزمىتى ئېلىپ بېرىلدى.ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ، تەكرار سان قاتارلىقلار ئايدىڭلاشتۇرۇلدى.، بۇ يەردە ئاساسلىقى qPCR نىڭ قوللىنىلىشىنى چۈشەندۈردۇق.
qPCR كەڭ قوللىنىلىدۇ ، تەجرىبە دەلىللەش ۋە يادرو كىسلاتاسىغا دىئاگنوز قويۇش ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان ئەھۋال.
مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇش
خاتىرە (دەسلەپكى قويۇقلۇقى) دەۋرىيلىك سانى بىلەن تۈز سىزىقلىق مۇناسىۋەتكە ئىگە.مەلۇم دەسلەپكى كۆپەيتىلگەن نومۇرى بار ئۆلچەمدىن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق سىزغىلى بولىدۇ ، يەنى كۈچەيتىش رېئاكسىيەسىنىڭ سىزىقلىق مۇناسىۋىتىگە ئېرىشكىلى بولىدۇ.ئەۋرىشكىنىڭ Ct قىممىتىگە ئاساسەن ، ئەۋرىشكىنىڭ قويۇقلۇقىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.ئۆز ئىچىگە ئالىدىغان قېلىپلارنىڭ مىقدارى.
مۇتلەق مىقدار ھېسابلاش ئۇسۇلى
مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇش چوقۇم ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنى ئاساس قىلىشى كېرەك.ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ياساش ئۈچۈن ئۆلچەم تەلەپ قىلىنىدۇ.ئادەتتە ، ئۆلچەملىك گېننى كلونلاش ئارقىلىق ئېرىشكەن پىلازما بولىدۇ.نېمىشقا پىلاستىك بولىدۇ؟چۈنكى ئايلانما پىلازما DNA ئەڭ مۇقىم.ئۆلچەملىك مەھسۇلاتنى 5 ھەسسىدىن 6 گىرادۇسقىچە ئارىلاشتۇرۇپ ، ھەسسىلەش نىسبىتىگە (10 ھەسسە سۇيۇلدۇرۇش) ، سۇيۇلدۇرغاندا بىردەكلىككە دىققەت قىلىڭ.Ct قىممىتى 15-30 ئارىلىقىدا چۈشسۇن.
ئۆلچەملىك تەييارلىق
شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكەمۇ ماس ھالدا سۇيۇلدۇرۇلۇشى كېرەك (سۇيۇلۇش ئامىلىنى ئېسىڭىزدە تۇتۇڭ) ، Ct قىممىتىمۇ 15-30 ئارىلىقىدا تۆۋەنلىشى كېرەك.سىناق قىلىنىدىغان ئۆلچەملىك مەھسۇلات + ئەۋرىشكە بىللە قويۇلدى.يۈگۈرگەندىن كېيىن ، ئۆلچەملىك ماددا بىلەن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ياسالدى ، سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكەلەر ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىققا ئېلىپ كېلىپ قويۇقلۇقىنى ھېسابلىدى.
B تىپلىق جىگەر ياللۇغى ۋىرۇسى HBV مىقدارى تىپىك مۇتلەق مىقدار بولۇپ ، ئۇ 1ml قاندىكى ۋىرۇسنىڭ كۆپەيتىلگەن سانىنى ھېسابلىيالايدۇ.
كۆپەيتىلگەن نومۇرنى ھېسابلاش
سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكە قويۇقلۇقى (ng / ul) = OD260 × 50ug / ml × سۇيۇلۇش ئامىلى
ئەۋرىشكە مولېكۇلا ئېغىرلىقى = ئاساسى سانى × 324
سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ كۆپەيتىلگەن نومۇرى (كۆپەيتىلگەن / ul) = سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ قويۇقلۇقى / ئەۋرىشكىنىڭ مولېكۇلا ئېغىرلىقى × 6 × 1014
كۆپەيتىلگەن نومۇرنىڭ ھېسابلاش ئۇسۇلى
يۇقارقىلار مىقدارنى ئېنىقلاشتىكى ھېسابلاش ئۇسۇلى.بۇ تولۇقسىز ئوتتۇرا مەكتەپنى پۈتتۈرگەندىن كېيىن ھەل قىلغىلى بولىدىغان ماتېماتىكىلىق مەسىلە ، ماتېماتىكىلىق مەسىلىلەر ئادەتتە كومپيۇتېر تەرىپىدىن ھەل بولىدۇ.چۈشەنمىسىڭىز ئالاقىلىشالايسىز.
نىسپىي مىقدار
نىسپىي مىقدارلاشتۇرۇش ئاساسلىقى ئىلمىي تەتقىقاتتا ئىشلىتىلىدۇ.1ml قاندا قانچىلىك ۋىرۇس بار ، ئۇ بىر DNA ۋىرۇسى ، بۇ بىر قەدەر ئېنىقلىما بېرىدىغان ھادىسە: قاننىڭ مىقدارىنى ئېنىقلىغىلى بولىدۇ ، DNA ۋىرۇسى بىر قەدەر تۇراقلىق.قانداقلا بولمىسۇن ، مەلۇم بىر گېننىڭ يوپۇرماقتىكى كۆچۈرۈلگەن كۆپەيتىلگەن نۇسخىسىنى سېلىشتۇرۇش بىز ئۈچۈن قىيىن ، چۈنكى يوپۇرماقنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى ، ئېغىرلىقى ۋە نازۇكلىقىنى ئېنىقلاش تەس ، ئېلىنغان RNA نىڭ مىقدارىنى ئېنىقلاش تەس ، تەتۈر كۆچۈرۈشنىڭ ئۈنۈمىنىمۇ ئېنىقلاش تەس ، يەنى ھەر قانداق قەدەم تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ كەمتۈك بولۇشى مۇمكىن ، ئۇنى ئىشلەتكىلى بولمايدۇ.
شۇڭلاشقا ، نىسپىي مىقدارلاشتۇرۇش چوقۇم بىر ئېلېمېنتنى تونۇشتۇرۇشى كېرەك:ئىچكى پايدىلىنىش گېنى.
باشقىچە ئېيتقاندا ، نىسپىي مىقدارلاشتۇرۇش ئەمەلىيەتتە نىشان گېنى بىلەن ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئوتتۇرىسىدىكى سېلىشتۇرما.ئوخشاش توقۇلما ۋە ئوخشاش ھۈجەيرىگە سېلىشتۇرغاندا ، ئەۋرىشكە چوڭلۇقى ، RNA ئېلىش مىقدارى ، تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمى ۋە PCR ئۈنۈمى بىر قەدەر كىچىك.ئەۋرىشكە چوڭلۇقى كىچىك بولغاچقا ، ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ۋە نىشان گېنى بىر قەدەر ئازايدى.شۇڭلاشقا بىز ئىلگىرى بىردەكلىك ۋە مۇقىملىقنى تەكىتلەپ كېلىۋاتىمىز.
ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئادەتتە بولىدۇئۆي ئاسراش گېنى(ئۆي ساقلاش گېنى) ، ئۇ بارلىق ھۈجەيرىلەردە مۇقىم ئىپادىلىنىدىغان گېن تۈرىنى كۆرسىتىدۇ ، ئۇلارنىڭ مەھسۇلاتلىرى ھۈجەيرىلەرنىڭ ئاساسىي ھايات پائالىيىتىنى ساقلاپ قېلىش ئۈچۈن زۆرۈر.
بۇ ئۇقۇمنى ئارىلاشتۇرۇۋەتمەڭ.ئۆي ئاسراش گېنى بىئولوگىيىلىك ئىقتىدار ئاتالغۇلىرى ، ئىچكى پايدىلىنىش گېنى بولسا تەجرىبە تېخنىكىلىق ئاتالغۇ.ئائىلە ئاسراش گېنى ئىچكى پايدىلىنىش گېنى قىلىپ تاللاشتىن بۇرۇن دەلىللەشتىن ئۆتۈشى كېرەك.
مەسىلەن ، بىز تۆۋەندىكى رەسىمدىكى بىر نەچچە ئۆي ئاسراش گېنىنى تاللاپ ، ئۇلارنىڭ ئوخشىمىغان توقۇلما ھۈجەيرىلىرىدىكى ئىپادىلەش دەرىجىسىنى سىنىدۇق ۋە β-2- مىكروبلوبىننىڭ ئىپادىلىنىش دەرىجىسىنىڭ باشقا ئۈچ گېنغا ئوخشىمايدىغانلىقىنى بايقىدۇق ، شۇڭا ئۇلارنى ئىچكى پايدىلىنىش گېنى قىلىپ ئىشلىتىشكە بولمايدۇ.
ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ تۈزىتىش ئىقتىدارىنى چۈشەنگەندىن كېيىن ، ئىچكى پايدىلىنىش گېنىنىڭ ئوتتۇرىغا چىقىشى سەۋەبىدىن ئىككى خىل ئالگورىزىم ھاسىل بولىدۇ.
· قوش ئۆلچەملىك ئەگرى ئۇسۇل
· 2 - △△ Ct ئۇسۇلى (CT قىممىتىنى سېلىشتۇرۇش ئۇسۇلى)
ئەگەر سىز تۈر ۋە گېن فۇنكسىيەسىنى تەتقىق قىلىشقا قىزىقسىڭىز ، ئالگورىزىم تەتقىقاتىدىن ۋاز كېچىپ ، فورمۇلانى بىۋاسىتە ئىشلىتىڭ ياكى بىۋاسىتە ماشىنا ئىشلىتىڭ.ئەگەر سىز ماتېماتىكا ۋە قۇرۇلۇش كەسپىدىكى تۈز يىگىت بولسىڭىز ، ئەركىن ئازادە ھېس قىلىڭ.
قوش ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق
كونترول ئەۋرىشكىسى ۋە ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئارقىلىق سىناق قىلىنىدىغان ئەۋرىشكىنىڭ نىشانلىق گېنى ۋە ئائىلە ئاسراش گېنىنى مىقدارلاشتۇرۇڭ ، ئاندىن نىسپىي قىممەتنى ھېسابلاش فورمۇلاسى بويىچە ھېسابلاڭ ، بۇ نىسپىي ئىپادىلەش دەرىجىسى.
ئارتۇقچىلىقى: ئاددىي تەھلىل ، بىر قەدەر ئاددىي تەجرىبە ئەلالاشتۇرۇش
كەمچىلىكى: ھەر بىر گېنغا نىسبەتەن ، ھەر بىر قېتىملىق سىناقتا چوقۇم ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق بولۇشى كېرەك
قوللىنىش: گېن ئىپادىلەشنى تەڭشەش تەتقىقاتىدا كۆپ قوللىنىلىدىغان ۋە ئېتىراپ قىلىنغان نىسپىي مىقدار ئۇسۇلىنىڭ بىرى
فورمۇلا تۆۋەندىكىچە:
مىساللار تۆۋەندىكىچە:
مىقدار نەتىجىسىگە ئاساسەن نىسپىي مىقدارنى ھېسابلاڭ
2 - t Ct ئۇسۇلى (CT قىممىتىنى سېلىشتۇرۇش ئۇسۇلى)
ئارتۇقچىلىقى: ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ياساشنىڭ ھاجىتى يوق
كەمچىلىكى: كۈچەيتىش ئۈنۈمى% 100 كە يېقىن دەپ قارىلىدۇئۆلچەملىك ئايلىنىش <5% ، ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق بىلەن ھەر بىر كۈچەيتكۈچ ئوتتۇرىسىدىكى ئۈنۈم بىردەك دەپ قارىلىدۇتەجرىبە شارائىتىنى ئەلالاشتۇرۇش تېخىمۇ مۇرەككەپ.
قوللىنىش: گېن ئىپادىلەشنى تەڭشەش تەتقىقاتىدا كۆپ قوللىنىلىدىغان ۋە ئېتىراپ قىلىنغان نىسپىي مىقدار ئۇسۇلىنىڭ بىرى
ئەلۋەتتە ، كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئادەتتە مۇكەممەل بولۇش مۇمكىن ئەمەس 1. تۈزىتىش ئۇسۇلى: ئەگەر بىز نىشان گېن بىلەن پايدىلىنىش گېنىنىڭ ئوخشاش كۈچەيتىش ئۈنۈمى بارلىقىنى بىلسەك ، ئەمما كۈچەيتىش ئۈنۈمى 1 گە تەڭ ئەمەس ، ئۇنداقتا 2－ △△ Ct نى تۆۋەندىكىدەك تۈزەتكىلى بولىدۇ:
ھازىرغا قەدەر ، فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR ھەققىدىكى مەزمۇنلار ئاخىرلاشتى.
يوللانغان ۋاقتى: Apr-06-2023
