كۆپچىلىك qRT-PCR تەجرىبىسى ، دەسلەپكى لايىھىلەش ، نەتىجىنى چۈشەندۈرۈش قاتارلىق پرىنسىپلارنى سۆزلەۋاتىدۇ ، ئەمما مېنىڭچە qRT-PCR نىڭ تەجرىبە مەشغۇلاتىنى سىز بىلەن ئورتاقلىشىشىم كېرەك.ئۇ كىچىك ، ئەمما ئۇ نەتىجىگە مۇناسىۋەتلىك.
QRT-PCR نى ئىشلەشتىن بۇرۇن ، ئۆزىمىزنىڭ RNA ۋە مەشغۇلات ئۇسۇللىرىنى ئېنىق چۈشىنىشىمىز كېرەك.نېمىلا دېگەنبىلەن ، بىزنىڭ تىرىشچانلىقىمىز ئاددىيلا مەشىق قىلماستىن ، بەلكى نەتىجىگە ئېرىشىشنى مەقسەت قىلىدۇ.شۇڭا qRT-PCR نى ئىشلەشتىن بۇرۇن ، بىز تۆۋەندىكى مەسىلىلەرنى ئېنىقلىشىمىز كېرەك (بۇلارنىڭ بەزىلىرى پەقەت SYBR غا ماس كېلىدۇ).
1 RNA نىڭ بۇزۇلمىغانلىقىغا ئىشىنەمسىز؟
NanoDrop 2000 پەقەت RNA نىڭ قويۇقلۇقى ۋە ساپلىقىنى بايقىيالايدۇ ، ئەمما RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى بايقىيالمايدۇ.
RNA (RNA Intesity Number) قىممىتى Agilent 2100 Bioanalyzer سىستېمىسى تەرىپىدىن بايقالغان RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى ئەكس ئەتتۈرەلەيدۇ.
ئوخشىمىغان RNA ئەۋرىشكىسى (eukaryotes) ئۈچۈن RIN قىممىتىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى.
قانداقلا بولمىسۇن ، تەجرىبىخانىلاردا ئادەتتە Agilent 2100 Bioanalyzer يوق.بۇ خىل ئەھۋالدا بىز فورمالدېگىد گېلى ئارقىلىق بايقىيالايمىز ، ئەمما RNA نىڭ ئومۇمىي مىقدارىغا بولغان تەلەپ يۇقىرى ، شۇڭا ئەڭ تېز ئۇسۇل ئادەتتىكى گېلى ئېلېكتروفورېز ئىشلىتىش.يادروسىز مۇھىتتا بولۇشى تەلەپ قىلىنىدۇ ، شۇڭا ئېلېكتروفورېز باكى ، سول بوتۇلكا ، گېلى تىرناق ۋە DEPC سۈيى بىلەن تاراش كېرەك.ئاگاروزامۇ يادروسىز (يېڭى ئېچىلسىلا) ، يۈك قاچىلاش باففېرنى ئىمكانقەدەر يېڭى ئېچىۋېتىش كېرەك ،% 1.2 گېلى بار.
شۇنىڭغا دىققەت قىلىڭكى ، گېلى چوقۇم تولۇق ئېرىپ كېتىشى كېرەك ، بولمىسا ئۇ 9-ئەۋرىشكىدە كۆرسىتىلگەندەك ، ئوخشاش بولمىغان بەلۋاغنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئەگەر توك بېسىمى بەك يۇقىرى بولسا ياكى بەك ئۇزۇن يۈرسە ئىسسىقلىق ھاسىل قىلىپ ، RNA نىڭ چېكىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، شۇڭا توك بېسىمى ۋە ۋاقىتنى مۇۋاپىق كونترول قىلىش كېرەك.ئۇنىڭدىن باشقا ، گېلى يۈگۈرۈش يەنە ئەۋرىشكەدە DNA قالدۇقىنىڭ بار-يوقلۇقىنى تېخىمۇ ئېنىقلىيالايدۇ ، ھەمدە تارقىتىش قۇدۇقىدا ساقلانغان بەلۋاغنىڭ كۆپ ياكى ئەمەسلىكىنى كۆزىتەلەيدۇ.
رەسىم.RNA نىڭ گېلى ئېلېكتروفورېز بايقاش
2 CDNA نىڭ قويۇقلۇقىغا ئىشىنەمسىز؟
تەجرىبىخانىدىكى چوڭ ئاكا-ئۇكىلارنىڭ تەجرىبىسى شۇكى ، ھەر قېتىملىق تەتۈر يۆنىلىشتە ئېرىشكەن 20 ul سىستېمىسىنىڭ CDNA بىۋاسىتە 20X سۇيۇلدى ، دوكتورلۇقتىن كېيىنكى ئاچا-سىڭىللار 10X سۇيۇلدى.مەن ئادەتتە ئەھۋالغا باغلىق.ھەر بىر ئادەم تىلغا ئالغان RNA نىڭ سۈپىتى ئوخشىمىغاچقا ، بۇرۇلۇش دەرىجىسىمۇ ئوخشىمايدۇ ، بۇرۇلۇش تېخنىكىسى مۇقىم بولماسلىقى مۇمكىن.
شۇڭا ھەر قېتىم قايتۇرۇلغان cDNA غا ئېرىشكىنىمدە ، ئالدى بىلەن ئۇنى 3 قېتىم ئەتراپىدا سۇيۇلدۇرىمەن ، ئاندىن ئائىلە ئاسراش گېنى ئارقىلىق RT-PCR نى ئىشلىتىمەن ، دەۋرىيلىك سانى ئادەتتە 25 دەۋرىيلىك بولۇپ ، كونكرېت قويۇقلۇقىنى ئېنىقلاپ ، ئاندىن ئاخىرقى سۇيۇلۇش ئامىلىنى ئېنىقلايمەن.
3 باشلانغۇچلىرىڭىزنىڭ ئىشلىتىش ئاسانلىقىغا ئىشىنەمسىز؟
ئۇ qRT-PCR نىڭ ئېرىتىش ئەگرى سىزىقىدىن ئۆتەلەيدۇ ، ئەمما بۇنىڭ ئۈچۈن يەنىلا پۇل كېتىدۇ.نۇرغۇن پۇلى يوق تەجرىبىخانىلارغا نىسبەتەن ، ئۇلار نۇرغۇن پىرىمېرلارغا ئېرىشكەندە ، ئادەتتىكى RT-PCR ئارقىلىق ئۇنىڭ تاق بەلۋاغ ياكى ئەمەسلىكىنى بىلەلەيدۇ ھەمدە پىرىمېرلارنىڭ خاسلىقىنى پەرقلەندۈرەلەيدۇ.ئەگەر تەجرىبىخانىدا پۇل كەم بولمىسا ، بارلىق پىرىمېرلارنىڭ خاسلىقىنى ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئارقىلىق بىر قېتىم بىلگىلى بولىدۇ.
4 تەجرىبە شارائىتىڭىزنىڭ ماس كېلىدىغانلىقىغا ئىشىنەمسىز؟
SYBR كۈچلۈك نۇردىن قوغدىلىشى كېرەك ، شۇڭا SYBR رېئاكتورى قوشقاندا ئۈستۈنكى چىراغنى ئۆچۈرۈڭ ، ئۇنى تاماملاش ئۈچۈن پەقەت غۇۋا نۇر ئىشلىتىش كېرەك.
SYBR نى ° C4 قا ساقلاڭ.ئىشلەتكەندە ، ئاستا-ئاستا تەتۈر تەتۈر ئايلاندۇرۇپ ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ ، كۆپۈكلىشىشتىن ساقلىنىڭ ، ھەمدە كۈچلۈك تەۋرەنمەڭ.
بەزى كىچىك ئاچا-سىڭىللار ئەۋرىشكە ئارىلاشتۇرۇشتىن ئەنسىرەپ PCR تاختىسىغا بەلگە سىزىشنى ياخشى كۆرىدۇ ، بۇ خاتا.بەلگىڭىزنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ توپلىنىشىغا تەسىر كۆرسىتىش ئېھتىماللىقى يۇقىرى بولغاچقا ، ئادەتتە قۇرامىغا يەتمىگەنلەرنىڭ تەجرىبە دەپتىرىنى ئىشلىتىپ ئەستە ساقلاشقا ياردەم قىلىشىنى تەۋسىيە قىلىمەن.
رەسىم.qRT-PCR ئەۋرىشكە يۈكلەش دىئاگراممىسى
5 ئۇنى توغرا قىلىۋاتقانلىقىڭىزغا ئىشىنەمسىز؟
پەلەي كىيىشكە ، پەلەي كىيىشكە ، پەلەي كىيىشكە ۋە مۇھىم ئىشلارنى ئۈچ قېتىم دېيىشكە كاپالەتلىك قىلىڭ.
SYBR نىڭ يورۇقلۇققا بولغان تەسىرىنى ئازايتىش ئۈچۈن ، مەن تۆۋەندىكى رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك ، ئالدى بىلەن قېلىپ قوشۇشنى ياخشى كۆرىمەن.تەجرىبىگە ئاساسلانغاندا ، ئاز مىقداردا قېلىپنىڭ قوشۇلۇشى ئەۋرىشكە ئېلىش خاتالىقىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.شۇڭلاشقا ، ئاز مىقداردا قېلىپ قوشۇشتىن كېلىپ چىققان خاتالىقنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن ، مەن ئادەتتە ئەۋرىشكىنى يەنە بىر قاتلايمەن ، ئەۋرىشكە قوشقاندا قوش ھەسسە قوشۇپ H2O2 قوشۇلغان مىقدارنى ئازايتىمەن.
رەسىم.QRT-PCR قاچىلاشنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى
ئاندىن qRT-PCR سىستېمىسىنى تۆۋەندىكىدەك تەڭشەڭ.
رەسىم.qRT-PCR سىستېمىسى تەييارلاش دىئاگراممىسى
ئەسكەرتىش: تەڭشەش جەريانى مۇز ئۈستىدە ئېلىپ بېرىلىشى كېرەك.
ئەۋرىشكە قوشقاندىن كېيىن ، سۈزۈك پېچەتلەش پەردىسىنى چاپلاڭ.قولىڭىز بىلەن سۈزۈك پېچەتلەنگەن فىلىمنىڭ يۈزىگە تەگمەسلىككە تىرىشىڭ ، پەقەت فىلىمنىڭ ئىككى تەرىپىدىكى بوشلۇقتىن مەشغۇلات قىلىڭ.چۈنكى بارماق ئىزى فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ توپلىنىشىغىمۇ تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن.ئاندىن سېنترىفۇگ ئىشلىتىپ ، تېز سۈرئەتتە 10 سېكۇنت تېز سۈرئەتتە مەركەزلەشتۈرۈپ ، ئەۋرىشكىنىڭ تامغا ئېسىلىپ كېتىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:
يوللانغان ۋاقتى: Apr-28-2023
