RT-qPCR تەجرىبىسى RNA ئېلىش ۋە سۈپەت باھالاش ، تەتۈر كۆچۈرۈش ۋە qPCR ئۈچ باسقۇچنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ھەر بىر قەدەمدە نۇرغۇن ئالدىنى ئېلىش تەدبىرلىرى بار ، تۆۋەندە تەپسىلىي تونۇشتۇرىمىز.

Ⅰ.RNA سۈپىتىنى باھالاش

RT-qPCR تەجرىبىسىدە ، RNA ئېلىش تاماملانغاندىن كېيىن ، RNA نىڭ سۈپىتىنى باھالاشقا توغرا كېلىدۇ ، كېيىنكى سىناقنى لاياقەتلىك بولغاندىن كېيىن ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.باھالاش ئۇسۇللىرى سپېكترو فوتومېتىر ، Agilent گېلى ئېلېكتروفورىسى ، Agilent 2100 تەھلىلى قاتارلىقلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان سپېكترو فوتومېتىر ۋە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېز ئۇسۇلىنى تەكشۈرۈش قاتارلىقلار بار.كۆرسىتىپ ئۆتۈشكە تېگىشلىكى شۇكى ، بۇ ئىككى خىل ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ ، RNA نىڭ قويۇقلۇقى ، ساپلىقى ۋە پۈتۈنلۈكىنى بايقاش ۋە تەھلىل قىلىشنى تاماملاپ ، RNA نىڭ سۈپىتىگە كاپالەتلىك قىلىش كېرەك.

مۇناسىۋەتلىك RNA ئايرىلىش زاپچىسى: 

ھۈجەيرە ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى

يۇقىرى ساپلاشتۇرۇلغان ۋە يۇقىرى سۈپەتلىك ئومۇمىي RNA نى 11 مىنۇتتا ھەر خىل مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەردىن ئېرىشكىلى بولىدۇ.

ھايۋانلارنىڭ ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى

ھەر خىل ھايۋان توقۇلمىلىرىدىن يۇقىرى ساپلىق ۋە يۇقىرى سۈپەتلىك ئومۇمىي RNA نى تېز ۋە ئۈنۈملۈك چىقىرىڭ.

Spectrophotometer:

سپېكترو فوتومېتىر ئاساسلىقى RNA نىڭ قويۇقلۇقى ۋە ساپلىقىنى ئېنىقلاشقا ئىشلىتىلىدۇ ، ئەمما ئۇ RNA ۋە گېن قالدۇقىنىڭ مۇكەممەللىكىنى بايقىيالمايدۇ.بۇنىڭ ئىچىدە ، A260 / 280 ۋە A260 / 230 RNA ساپلىقىنى بايقاشنىڭ مۇھىم پارامېتىرلىرى بولۇپ ، RNA ساپلىقىنى ئۇلارنىڭ قىممىتىنىڭ ئۆزگىرىشىگە ئاساسەن بايقىغىلى بولىدۇ:

1. 1.9 2.1 ، RNA نىڭ قىسمەن بۇزۇلۇشىنى كۆرسىتىدۇ ، بۇنى ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى ئارقىلىق تېخىمۇ جەزملەشتۈرگىلى بولىدۇ.

2. 2.0

ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى:

ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېز ئانالىزى RNA پۈتۈنلۈكى ، گېن ۋە ئاقسىل قالدۇقىنى تەھلىل قىلالايدۇ ، ئەمما RNA نىڭ قويۇقلۇقىنى توغرا مىقدارلاشتۇرالمايدۇ ياكى ئورگانىك رېئاكتورنىڭ قالدۇقلىرىنى بايقىيالمايدۇ.ئېۋكارىئوتىك RNA قېلىپىنى مىسالغا ئالايلى:

1. RNA ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسىغا ئۇچرىدى.ئەگەر گېلى خەرىتىدە پەقەت 28sRNA ، 18sRNA ۋە 5.8sRNA دىن ئىبارەت ئۈچ تاق بەلۋاغ بولغان بولسا ، ئېلىنغان RNA نىڭ مۇكەممەل ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ.ئەگەر سۆرەش ھادىسىسى بولسا ، ئۇ RNA نىڭ قىسمەن چېكىنىشىنى كۆرسىتىدۇ.

2. ئەگەر يېلىم تۆشۈكى بىلەن 28sRNA بەلۋاغ ئارىسىدا بىرلا يورۇق بەلۋاغ بولسا ، گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA قالدۇقى بولۇشى مۇمكىن.

3. ئەگەر يېلىم تۆشۈكىدە بەلۋاغ پەيدا بولسا ، بۇ ئاقسىل ۋە باشقا ماكرو مولېكۇلا ماددىلىرىنىڭ قالدۇقلىرىنىڭ بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىدۇ.

Ⅱ. تەتۈر كۆچۈرۈلۈش

RNA ئېلىش تاماملانغاندىن كېيىن ، كېيىنكى سىناقلار ئۈچۈن ئۇنى cDNA غا ئۆزگەرتىش كېرەك ، شۇڭا بۇرۇلۇش باسقۇچى ئىنتايىن مۇھىم.تەتۈر ترانسكرىپسىيە ۋە دەسلەپكى تاللاشنى تاللاشتىن تەتۈر كۆچۈرۈلىدۇ:

تەتۈر كۆچۈرۈلگەن تاللاش:

تىپىك تەتۈر كۆچۈرۈلگەن خاتىرىلەر AMV RTase ۋە MMLV RTase نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.AMV RTase نىڭ RNase H كۈچلۈك ھەرىكەتچانلىقى ، قىسقا بىرىكمە ئۇزۇنلۇقى ، بىرىكتۈرۈش مىقدارى تۆۋەن ۋە ئىسسىقلىق مۇقىملىقى ياخشى (42 ~ 55 has).MMLV RTase نىڭ RNase H پائالىيىتى ئاجىز ، بىرىكمە ئۇزۇنلۇقى ئۇزۇن ، بىرىكتۈرۈش مىقدارى يۇقىرى ، ئىسسىقلىق مۇقىملىقى ناچار (37 ~ 42 ℃).

RNase H ئېنزىم RNA قېلىپىنى تۆۋەنلىتىش ئىقتىدارىغا ئىگە بولغاچقا ، RNase H پائالىيىتى ئاجىز بولغان MMLV تەتۈر كۆچۈرۈلۈش جەريانىدا ئەۋزەل تاللىنىشى كېرەك ، كېيىن گېن قۇرۇلۇشىدىن كېيىن ، MMLV نىڭ ئىسسىقلىق مۇقىملىقى سۈپەتلىك سەكرەشكە يەتتى.ForegeneForeasy تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (تەتۈر ترانسكرىپسىيە ئۈچۈن M-MLV) مەسىلەن ، ئۇ E. coli ئىنژېنېرلىق باكتېرىيەسىدە گېننى قايتا ھاسىل قىلىش تېخنىكىسى ئارقىلىق ئىپادىلەنگەن يېڭى تەتۈر كۆچۈرۈلگەن.ئۇ قايتا ھاسىل بولىدىغان DNA پولىمېراسى بولۇپ ، يەككە تاق RNA ، DNA ياكى RNA: DNA ئارىلاشمىسىدىن تولۇقلانغان DNA يولىنى بىرىكتۈرىدۇ.ئۇنىڭ RNase H پائالىيىتى ، كۈچلۈك مۇقىملىقى ، كۈچلۈك RNA يېقىنلىقى ۋە بايقاش سەزگۈرلۈكى يوق.

 

Foreasy تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (تەتۈر ترانسكرىپسىيە ئۈچۈن M-MLV)

دەسلەپكى تاللاش:

ئادەتتە RT پىرىسلاشلىرى oligo dT ، تاسادىپىي پىرىسلاش ۋە گېنغا خاس پىرىمچىكتىن ئىبارەت ئۈچ تۈرگە بۆلىنىدۇ.ئوخشىمىغان تەجرىبە تەلىپىگە ئاساسەن ئىشلىتىشكە ماس كېلىدىغان دەسلەپكى تاللاشلارنى تاللاڭ.

1. ئەگەر قېلىپ ئېۋكارىئوتىك مەنبەدىن بولۇپ ، كېچىكىپ cDNA دائىملىق PCR كېڭەيتىشكە ئىشلىتىلسە ، Oligo (dT) تەۋسىيە قىلىنىدۇ.ئەگەر كېيىنكى تەجرىبە پەقەت qPCR ئۈچۈنلا ئىشلىتىلسە ، Oligo (dT) نى ئىختىيارى پىرىس بىلەن ئارىلاشتۇرۇپ ، تەتۈر كۆچۈرۈش ئۈنۈمىنى ئۆستۈرۈش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

2. ئەگەر قېلىپ پروكارىئوتتىن بولسا ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئۈچۈن ئىختىيارى پىرىمېر ياكى گېن ئالاھىدە پىرىمېرنى تاللاش كېرەك.

Ⅲ.qPCR

فلۇئورېسسېنسىيە مىقدارلاشتۇرۇش ئاساسلىقى مىقدار ئۇسۇلى ، دەسلەپكى لايىھىلەش پرىنسىپى ، ROX تاللاش ، ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ سەپلىمىسى ۋە ئىنكاس شارائىتىنى تەڭشەش قاتارلىقلاردىن تەپسىلىي بايان قىلىنغان.

مىقدار ئۇسۇلىنى تاللاش:

مىقدار ئۇسۇلى نىسپىي مىقدار ئۇسۇلى ۋە مۇتلەق مىقدار ئۇسۇلىغا ئايرىلىدۇ.نىسپىي مىقدارلاشتۇرۇش ئارقىلىق بەزى داۋالاش ئۇسۇللىرىنىڭ گېننىڭ ئىپادىلىنىشىگە بولغان تەسىرىنى بايقاش ، ئوخشىمىغان ۋاقىتتا گېن ئىپادىسىنىڭ پەرقىنى بايقاش ۋە ئوخشىمىغان توقۇلمىلاردىكى گېن ئىپادىسىنىڭ پەرقىنى سېلىشتۇرۇشقا بولىدۇ.مۇتلەق مىقدار ۋىرۇستىكى يادرو كىسلاتاسىنىڭ مىقدارىنى بايقىيالايدۇ.تەجرىبە قىلغاندا ، چوقۇم ئۆزىمىزنىڭ تەجرىبىسىگە ئاساسەن مۇۋاپىق مىقدار ئۇسۇلىنى تاللىشىمىز كېرەك.

دەسلەپكى لايىھىلەش پرىنسىپى:

QPCR نىڭ دەسلەپكى لايىھەلىنىشى كۈچەيتىش ئۈنۈمى ۋە مەھسۇلاتنىڭ كونكرېتلىقى بىلەن بىۋاسىتە مۇناسىۋەتلىك.شۇڭلاشقا ، ياخشى پىرىسلارنى توغرا لايىھىلەش مۇۋەپپەقىيەتلىك qPCR نىڭ بىرىنچى قەدىمى.پىرىمېر لايىھىلەشتە ، ئادەتتىكى پرىنسىپ لايىھىلەش پرىنسىپىغا ماس كەلگەندە تۆۋەندىكى پرىنسىپلارغا دىققەت قىلىش كېرەك:

1. نىشان بۆلەكنىڭ ئۇزۇنلۇقى 100 دىن 300 bp ئارىلىقىدا كونترول قىلىنىدۇ.

2. گېن ھالقىغان لايىھە گېن گۇرۇپپىسىنىڭ تەسىرىدىن ساقلىنىش

3. لايىھىلەنگەن پىرىسلار كۈچەيتمە ئۈنۈمنى سىناشقا موھتاج ، پەقەت كۈچەيتىش ئۈنۈمى ئۆلچەمگە يەتكەندە (% 90-110) ئاندىن مىقدار تەجرىبىسىگە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.

4. دەسلەپكى قويۇقلۇقى ئادەتتە 0.1uM بىلەن 1.0uM ئارىلىقىدا ئەلالاشتۇرۇلىدۇ.

تاللاشROX:

مىقدار رېئاكسىيەسى جەريانىدا ، ROX ئوپتىكىلىق يول پەرقىنى ، تۇرۇبا يولى خاتالىقى ياكى پارغا ئايلىنىش ۋە قويۇقلىشىشتىن كېلىپ چىققان ئاۋاز پەرقىنى تەڭ تەڭشىيەلەيدۇ ، نەتىجىنىڭ تەكرارلىنىشىنى ياخشىلايدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، شۇنىڭغا دىققەت قىلىش كېرەككى ، ROX نى تاللاش ئەسۋاب بىلەن مۇناسىۋەتلىك.ئەگەر qPCR قورالىنىڭ تۆشۈك پەرقىنى ئاپتوماتىك تۈزىتىش ئىقتىدارى بولسا ، ROX قوشۇشنىڭ ھاجىتى يوق.بولمىسا ، ئۇ ROX تۈزىتىشنى قوشۇشى كېرەك.رېئاكتور سېتىۋېلىشتىكى كىچىك شېرىكلەر چوقۇم توغرا ROX نى تاللاشتا ئىشلىتىلىدىغان قورالغا ئاساسەن بولۇشى ، كېيىنكى خاتالىقلاردىن ساقلىنىشى كېرەك.

ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ تەييارلىنىشى:

20ul ۋە 50ul نىڭ ئىنكاس ھەجىمى ياخشى كۆرىلىدۇ.سىستېما تۈزۈلگەندە تۆۋەندىكى ئىشلارغا دىققەت قىلىش كېرەك:

1. رېئاكسىيە سىستېمىسى دەرىجىدىن تاشقىرى پاكىز خىزمەت پونكىتى ، يېڭى ddH دا ھاۋا ئالماشتۇرۇش ئارقىلىق تەييارلىنىشى كېرەك₂O ھەر قېتىملىق سىناقتا ئىشلىتىلىدۇ.

2. ھەر بىر سىناقتا NTC تەييارلاپ ، سىستېمىدا بۇلغىنىشنىڭ بار-يوقلۇقىنى دەلىللەش كېرەك ، ھەر بىر جۈپ پىرىسلاش سىستېمىسى سىستېمىنى تەييارلىغاندا NTC قىلىشى كېرەك.

3. RNA قېلىپىدا gDNA قالدۇقىنىڭ بار-يوقلۇقىنى بايقاش ئۈچۈن ، ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن NRT تەييارلىغىلى بولىدۇ.

4. سىستېمىنى تەييارلىغاندا ، بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن كەم دېگەندە 3 قېتىم تېخنىكىلىق تەكرارلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

5. قېلىپ cDNA بولغاندا ، 5-10 قېتىم سۇيۇلدۇرۇپ ، تەتۈر كۆچۈرۈش سىستېمىسىنىڭ qPCR تەجرىبىسىگە بولغان چەكلەش ئۈنۈمىنى تۆۋەنلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.قېلىپنىڭ مىقدارىنى تەدرىجىي تەتقىق قىلىش ياخشىراق ، بۇنداق بولغاندا CT قىممىتى 20-30 ئارىلىقىدا تۆۋەنلەيدۇ.

6. تەلەپتىكى ئىنكاس سانىنى ئېنىقلاپ ، ئىنكاس سانىغا ئاساسەن% 5-10 ئاشۇرۇش ، ئاۋاز سەپلىمە سانىنى ھېسابلاش ؛

7 ، سىستېما دەسلەپكى پرىنسىپتىن پايدىلىنىپ تەييارلانغان بولۇپ ، مەركەزدىن قاچقاندىن كېيىن ئارىلاشتۇرۇپ ، كۆپۈككە كاپالەتلىك قىلمايدۇ.

8 ، ئىمكانقەدەر قوللايدىغان ئىستېمال بۇيۇملىرىنى تاللاش.

مۇناسىۋەتلىك RT-qPCR Kit