بايقاشنىڭ كونكرېتلىقى
كۆپىنچە ئەھۋاللاردا ، دەسلەپكى لايىھىلەشنىڭ مەقسىتى PCR نىڭ خاسلىقىنى ئەڭ يۇقىرى چەككە يەتكۈزۈش.بۇ نۇرغۇن ئۆزگەرگۈچى مىقدارنىڭ ئازدۇر-كۆپتۇر ئالدىن پەرەز قىلىش كۈچى تەرىپىدىن بەلگىلىنىدۇ.بىر مۇھىم ئۆزگەرگۈچى مىقدار دەسلەپكى 3′end دىكى تەرتىپ.
مۇھىمى ، PCR ئېنىقلىق ئۈچۈن لايىھەلەنگەن بولۇپ ، كەڭ ھەرىكەتچان دائىرىدە يۇقىرى ئۈنۈمنى ساقلاپ قالالايدۇ ، چۈنكى بۇ سىناق ئالاھىدە كۈچەيتمە مەھسۇلات ئىشلەپچىقارمايدۇ ، بۇ ئارقىلىق PCR رېئاكتورى بىلەن رىقابەتلىشىدۇ ياكى ئاساسلىق كۈچەيتمە ئىنكاسىنى چەكلەيدۇ.
ئەلۋەتتە ، بەزى ئەھۋاللاردا ، كونكرېتلىق ئەڭ مۇھىم ئەمەس ، مەسىلەن ، نىشان زىچ مۇناسىۋەتلىك ، ئەمما ئوخشىمىغان كېسەللىك قوزغاتقۇچىنى مىقدارلاشتۇرغاندا ، ئالاھىدە لايىھىلەش ، ئەلالاشتۇرۇش ۋە دەلىللەش ئۆلچىمى تەلەپ قىلىنىدۇ.
ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئامپلوننىڭ كونكرېتلىقىنى باھالاشنىڭ ئۆلچەملىك ئۇسۇلى ، ھېچ بولمىغاندا بىرلا نىشاننى كېڭەيتىش-ئاشۇرماسلىق جەھەتتە.قانداقلا بولمىسۇن ، شۇنى تەكىتلەش كېرەككى ، ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئادەمنى قايمۇقتۇرىدۇ ، مەسىلەن ، ئۇلار ئىككىلەمچى پىرىمېر ۋە تۆۋەن قېلىپ قويۇقلۇقىنىڭ بىرلەشمە تەسىرىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.
P5 |ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئوخشىمىغان مىقداردىكى ئىككى نىشان DNA نى تەكشۈرۈشتىن ئېرىشكەن Tm نىڭ ئۆزگىرىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
A. يۇقىرى قويۇقلۇق دەرىجىسى (ئېلان) دا ، qPCR ئۆلچەش تاماملانغاندىن كېيىن روشەن دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ يوق.قېلىپنىڭ قويۇقلۇقى 50 نۇسخا (e) غا تۆۋەنلىگەندە ، ئالاھىدە بولمىغان مەھسۇلات كۆرۈنۈشكە باشلايدۇ ۋە ئەڭ تۆۋەن قويۇقلۇقتىكى بىردىنبىر مەھسۇلاتقا ئايلىنىدۇ.
B. سىناق بارلىق نىشان قويۇقلۇقىدا ئوخشاش Tms نى خاتىرىلىدى ، ئەڭ تۆۋەن قويۇقلۇقىدىمۇ ئېنىق دەسلەپكى كۆرسەتكۈچ يوق (5 نۇسخا).بۇ ئىككى خىل بايقاش ئۇسۇلىنى قوللانغاندا ، NTC دا كۈچەيتمە مەھسۇلات بايقالمىدى.
P5 ئوخشىمىغان قويۇقلۇقتا قېلىپ بار ئەۋرىشكە بىلەن ئېرىشكەن ئېرىتىش ئەگرى سىزىقىنى كۆرسىتىدۇ.P 5a نىڭ كۆرسىتىشىچە ، ئەڭ تۆۋەن ئىككى قويۇقلۇقتا ، ئىشلەپچىقىرىلغان ئالاھىدە كۈچەيتمە مەھسۇلاتلارنىڭ Tms ى كونكرېت ئامپلوننىڭكىدىن تۆۋەن.
ئېنىقكى ، بۇ بايقاش ئۇسۇلىنى ئىشەنچلىك ھالدا تۆۋەن قويۇقلۇقتىكى نىشانلارنى بايقاشقا بولمايدۇ.
قىزىقارلىق يېرى ، NTC لار ، يەنى ھېچقانداق DNA يوق ئەۋرىشكەلەر (ئېنىق بولمىغان) كۈچەيتمە مەھسۇلاتلارنى خاتىرىلىمىگەن ، بۇ ئارقا كۆرۈنۈشتىكى گېن DNA نىڭ كونكرېت بولمىغان كۈچەيتىش / پولىمېرلىشىشقا قاتنىشىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بەزىدە بۇ خىل تەگلىك پىرىسلاش ۋە كونكرېت بولمىغان كۈچەيتكۈچنى ئوڭشاشقا بولمايدۇ ، ئەمما ھەمىشە قېلىپنىڭ قويۇقلۇقى ۋە NTC (P 5b) دا ئېنىق بولمىغان كۈچەيتكىلى بولمايدىغان بايقاش ئۇسۇلىنى لايىھىلەش مۇمكىن.
بۇ يەردە ھەتتا Cq 35 بولغان نىشان قويۇقلۇقىنىڭ كۈچەيتىلگەنلىكىنى خاتىرىلىسىڭىزمۇ ئالاھىدە ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ھاسىل بولىدۇ.ئوخشاشلا ، NTC دا ئېنىق بولمىغان كېڭەيتىش ئالامەتلىرى كۆرۈلمىدى.بەزىدە ، بايقاش ھەرىكىتى بەلكىم ئانا ھارىقىغا باغلىق بولۇشى مۇمكىن ، پەقەت بۇففېر تەركىبلىرىدە پەقەت ئالاھىدە بولمىغان كۈچەيتكۈچلا بايقالغان ، بۇ بەلكىم ئوخشىمىغان Mg2 + قويۇقلۇقى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن.
بايقاشنىڭ مۇقىملىقى
Ta نى ئەلالاشتۇرۇش qPCR بايقاشنىڭ تەجرىبە دەلىللەش ۋە ئەلالاشتۇرۇش جەريانىدىكى پايدىلىق قەدەم.ئۇ NTC نى كۈچەيتمەي تۇرۇپ ئەڭ تۆۋەن Cq ھاسىل قىلىدىغان تېمپېراتۇرا (ياكى تېمپېراتۇرا دائىرىسى) نى كۆرسىتىپ دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ كۈچلۈكلىكىنى بىۋاسىتە كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
سەزگۈرلۈكتىكى ئىككى-تۆت ھەسسە پەرقى mRNA ئىپادىسى يۇقىرى كىشىلەر ئۈچۈن مۇھىم بولماسلىقى مۇمكىن ، ئەمما دىئاگنوز قويۇش سىنىقىدا ، بۇ ئاكتىپ ۋە يالغان پاسسىپ نەتىجىنىڭ پەرقىدىن دېرەك بېرىشى مۇمكىن.
QPCR پىرىمېرلىرىنىڭ Ta خۇسۇسىيىتى ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.بەزى سىناقلار ئۇنچە پۇختا ئەمەس ، ئەگەر دەسلەپكى تاللاشنىڭ ئەڭ ياخشى Ta قىممىتى ئاستىدا ئېلىپ بېرىلمىسا ، ئۇلار تېزلا يىمىرىلىدۇ.
بۇ ناھايىتى مۇھىم ، چۈنكى بۇ خىل بايقاش رېئال دۇنيادا دائىم مەسىلە كۆرۈلىدۇ ، ئەۋرىشكىنىڭ ساپلىقى ، DNA نىڭ قويۇقلۇقى ياكى باشقا DNA نىڭ بولۇشى ئەڭ ياخشى بولماسلىقى مۇمكىن.
ئۇنىڭدىن باشقا ، نىشان نۇسخا نومۇرى كەڭ دائىرىدە ئوخشىماسلىقى مۇمكىن ، رېئاكتور ، سۇلياۋ قاچا ياكى ئەسۋابلار سىناقنى ئىشلەتكەندە ئىشلىتىلگەنگە ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.
P6 | تېمپېراتۇرا تەدرىجىي PCR بايقاشنىڭ ئوخشىمىغان كۈچلۈكلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
A. Bioline نىڭ Sensifast SYBR mastermix (مۇندەرىجە نومۇرى BIO-98050) ئارقىلىق ئىنسانلارنىڭ مېڭىسى RNA دىن تەييارلانغان cDNA دا PCR ئىجرا قىلىڭ.
Б.
C. ACSBG1 نىڭ كۈچەيتىلگەن گرافىك ۋە ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP نىڭ كۈچەيتىلگەن گرافىك ۋە تارقىتىلىش ئەگرى سىزىقى (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs ئوخشىمىغان تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىدا خاتىرىلەنگەن بولۇپ ، Cq نىڭ 7C تېمپېراتۇرا دەرىجىسىدە خاتىرىلەنگەن پەرقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
P 6 ئارزۇ قىلمايدىغان سىناقنىڭ تىپىك نەتىجىسىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ يەردە qPCR 59C بىلەن 67C (P 6a) ئارىلىقىدىكى تەدرىجىي ۋەزىپە ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىپ ، ئىنسانلارنىڭ مېڭىسىگە خاس ئۈچ گېنى بار.
كۈچەيتمە گرافىكتىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى ، ئوپالىن پىرىمېرلىرى كۆڭۈلدىكىدەك ئەمەس ، چۈنكى ئۇلارنىڭ ئەڭ ياخشى Ta دائىرىسى ئىنتايىن تار (6b رەسىم) ، يەنى Cqs كەڭ تارقالغان ، نەتىجىدە Cqs ئەڭ ياخشى Cqs Low بىلەن سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك بولغان.
بۇ بايقاش ئۇسۇلى تۇراقسىز بولۇپ ، تۆۋەن دەرىجىدىكى كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.شۇڭلاشقا ، بۇ بىر جۈپ پىرىسنى قايتىدىن لايىھىلەش كېرەك.ئۇنىڭدىن باشقا ، ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئانالىزى (قىستۇرما) شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى ، بۇ بايقاش ئۇسۇلىنىڭ كونكرېتلىقىمۇ مەسىلە بولۇشى مۇمكىن ، چۈنكى ھەر بىر Ta نىڭ ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئوخشىمايدۇ.
P 6c دا كۆرسىتىلگەن ACSBG1 بايقاش ئۇسۇلى يۇقىرىدىكى ئوپالىننى بايقاش ئۇسۇلىغا قارىغاندا تېخىمۇ كۈچلۈك ، ئەمما ئۇ يەنىلا كۆڭۈلدىكىدەك ئەمەس ، بەلكىم ئۇنى ياخشىلىشى مۇمكىن.
قانداقلا بولمىسۇن ، بىز كۈچلۈكلۈك بىلەن كونكرېتلىق ئوتتۇرىسىدا ھېچقانداق باغلىنىشنىڭ يوقلىقىنى تەكىتلەيمىز ، چۈنكى بۇ بايقاش ئۇسۇلى ئارقىلىق ھاسىل بولغان ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى بارلىق Tas (inset) دىكى ئوخشاش چوققا قىممەتنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
يەنە بىر جەھەتتىن ، كۈچلۈكلۈك سىنىقى تېخىمۇ كەڭ قورساق بولۇپ ، P 6d دا كۆرسىتىلگەن GFAP سىنىقىغا ئوخشاش ، Tas نىڭ كەڭ دائىرىدە مۇشۇنىڭغا ئوخشاش Cqs ئىشلەپچىقىرىدۇ.
ئوخشاش 8 سېلسىيە گرادۇس ئارىلىقىدا ئېرىشكەن Cqs نىڭ پەرقى 1 گە يەتمەيدۇ ، ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى (قىستۇرما) بۇ تېمپېراتۇرا دائىرىسىدىكى بايقاش ئالاھىدىلىكىنى ئىسپاتلايدۇ.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى ، ھېسابلانغان ۋەزىپە بىلەن ئەمەلىي Ta دائىرىسى ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.
تەتقىقاتچىلارنىڭ ئۈنۈملۈك پىرىمېر لايىھىلەشكە ياردەم بېرىش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن نۇرغۇن كۆرسەتمىلەر بار ، ئۇلارنىڭ كۆپىنچىسى ئۇزۇندىن بۇيان بېكىتىلگەن قائىدىلەرنى ئاساس قىلغان بولۇپ ، پىرىزدېنتلارنىڭ 3-كۈنىگە نۇرغۇن دىققەت قىلىنغان.دائىم G ياكى C نى 3 'ئاخىرىغا ۋە ئىككى G ياكى C بازىسىنى (GC قىسقۇچ) ئۆز ئىچىگە ئېلىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ ، ئەمما يېقىنقى 5 بازىنىڭ ئىككىدىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك.
ئەمەلىيەتتە ، بۇ قائىدىلەر تەتقىقاتچىلارنى يېتەكلىيەلەيدۇ ، ئەمما ئۇلار ھەر قانداق ئەھۋالدا توغرا بولۇشى ناتايىن.
P7 |پىرىماتنىڭ 3′end ئېنىقلىقى ياكى ئۈنۈمىگە ئانچە چوڭ تەسىر كۆرسىتەلمەيدۇ.
جاۋاب: ئىنسانلارنىڭ HIF-1α (NM_181054.2) گېنى ئۈچۈن پىرىمېرلارنىڭ ئورنى.
B. Agilent Brilliant III SYBR يېشىل ئانا ھاراق (مۈشۈك 600882) ئىشلىتىپ ئالتە سىناق تۈرىنى كۈچەيتىڭ.
C. Bio-Rad نىڭ CFX qPCR قورالى ۋە 3′end پىرىسلانغان خاتىرىلەش كۈچەيتىلگەن گرافىك ۋە ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى.NTC لار قىزىل رەڭدە كۆرسىتىلدى.
D. ھەر بىر سىناق تۈرنىڭ خاتىرىسى
مەسىلەن ، P 7 دىكى نەتىجە 3′end قائىدىسىگە زىت.بارلىق لايىھەلەر ئاساسەن ئوخشاش نەتىجىنى بارلىققا كەلتۈرىدۇ ، پەقەت ئىككى خىل دەسلەپكى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق NTC دا ئېنىق بولمىغان كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
قانداقلا بولمىسۇن ، بىز GC قىسمىنىڭ ئۈنۈمىنى قوللىيالمايمىز ، چۈنكى بۇ ئەھۋالدا ، A ياكى T نى ئەڭ كۆپ بولغاندا 30 بازا قىلىپ ئىشلىتىش كونكرېتلىقنى ئازايتمايدۇ.
F سىنىقى GGCC دا ئاخىرلاشقان C سىناقتا ، NTCs دا Cqs خاتىرىلەنگەن ، بۇ 30 دىن كېيىن بۇ تەرتىپلەردىن ساقلىنىشنى خالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بىز شۇنى تەكىتلەيمىزكى ، دەسلەپكى جۈپلەرنىڭ ئەڭ ياخشى 3 ′ رەت تەرتىپىنى بەلگىلەشنىڭ بىردىنبىر ئۇسۇلى بەزى كاندىداتلارنىڭ دەسلەپكى سىناقلىرىنى باھالاش.
كۈچەيتىش ئۈنۈمى
مۇھىمى ، گەرچە ئېنىق بولمىغان PCR بايقاش ھەرگىزمۇ كونكرېت بولۇپ كېتەلمىسىمۇ ، ئەمما فېرمېنت ، ئانا ھارىقى ، خۇرۇچ ۋە ۋېلىسىپىت مىنىش شارائىتىنى ئۆزگەرتىش ئارقىلىق كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى ئوخشىمىغان ئۇسۇللار بىلەن تەڭشىگىلى ۋە ئەڭ زور دەرىجىدە ئاشۇرغىلى بولىدۇ.
PCR بايقاش ئۈنۈمىنى باھالاش ئۈچۈن ، ئەڭ ياخشىسى نىشانلىق يادرو كىسلاتاسىنىڭ 10 ياكى 5 ھەسسىسىگە ، يەنى «ئۆلچەملىك ئەگرى ئۇسۇل» دىن تەرتىپلىك سۇيۇلدۇرۇش كېرەك.
ئەگەر PCR ئامپىكون ياكى بىرىكمە DNA نىشانلىرى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلىشقا ئىشلىتىلسە ، بۇ نىشانلارنىڭ تەرتىپلىك ئۆزگىرىشىنى دائىملىق مىقداردىكى DNA (مەسىلەن گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA) بىلەن ئارىلاشتۇرۇش كېرەك.
P8 |PCR نىڭ ئۈنۈمىنى باھالاش ئۈچۈن ئەگرى سىزىق.
A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ۋە R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ۋە Agilent نىڭ Brilliant III SYBR يېشىل ئۇستازى (مۇندەرىجە نومۇرى 600882) ئۈچۈن PCR ۋە ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ئۈچۈن پىرىمېر ئىشلىتىڭ.
B. 100 ng RNA تەتۈر كۆچۈرۈلۈپ ، 2 قېتىم سۇيۇلدى ۋە تەرتىپلىك سۇيۇلدۇرۇلغان CDNA ئەۋرىشكىسى 5 قېتىم ئىنسانلارنىڭ گېن گۇرۇپپىسىغا سۇيۇلدى.كىرىشتە ئەگرى سىزىق كۆرسىتىلىدۇ.
C. RT نىڭ ئىنكاسى ، سۇيۇلۇشى ۋە تەرتىپلىك سۇيۇلۇشى ئىككىنچى cDNA ئەۋرىشكىسى ئۈچۈن تەكرارلاندى ، نەتىجىسى ئوخشاش بولدى.
P 8 ئىككى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنى كۆرسىتىدۇ ، ئوخشاش بولمىغان ئىككى خىل cDNA ئەۋرىشكىسىدە ئوخشاش بايقاش ئۇسۇلىنى قوللىنىدۇ ، نەتىجىسى ئوخشاش ئۈنۈم ، تەخمىنەن% 100 ، R2 قىممىتىمۇ ئوخشاش ، يەنى تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن چېكىنىش سىزىقى ياكى سانلىق مەلۇمات دەرىجىسى ئوتتۇرىسىدىكى ماسلىشىش دەرىجىسى.
ئىككى ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنى سېلىشتۇرۇشقا بولىدۇ ، ئەمما پۈتۈنلەي ئوخشاش بولمايدۇ.ئەگەر نىشان نىشاننى توغرا مىقدارلاشتۇرۇش بولسا ، دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، ئېنىقسىزلىقنى چۈشەندۈرمەي تۇرۇپ كۆپەيتىلگەن نومۇر ھېسابلاش بىلەن تەمىنلەشنى قوبۇل قىلغىلى بولمايدۇ.
P9 |ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئارقىلىق مىقدارلاشتۇرۇش بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئۆلچەش ئېنىقسىزلىقى.
A. GAPDH (NM_002046) ئۈچۈن پىرىمېر ئىشلىتىپ PCR ۋە ئېرىتىش ئەگرى شارائىتىنى ئىجرا قىلىڭ.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ۋە R: TAACTGGTTGAGCACAGG ۋە Bioline نىڭ Sensifast SYBR ئۇستىسى (مۇندەرىجە نومۇرى BIO-98050).
B. كۈچەيتىش جەدۋىلى ، ئېرىتىش ئەگرى سىزىقى ۋە Bio-Rad نىڭ CFX qPCR ئەسۋابى بىلەن خاتىرىلەنگەن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق.
C. ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ۋە 95% ئىشەنچ ئارىلىقى (CI).
D. كۆپەيتىش ئەگرى سىزىقىدىن ھاسىل بولغان ئۈچ Cq قىممىتىنىڭ كۆپەيتىلگەن نومۇرى ۋە% 95 ئىشەنچ ئارىلىقى.
P 9 نىڭ كۆرسىتىشىچە ، ئەلالاشتۇرۇلغان سىناق ئۈچۈن ، يەككە ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقنىڭ ئەسلىدىكى ئۆزگىرىشچانلىقى تەخمىنەن 2 ھەسسە (% 95 ئىشەنچ ئارىلىقى ، ئەڭ تۆۋەن بولغاندا ئەڭ چوڭ) بولۇپ ، مۆلچەردىكى ئەڭ كىچىك ئۆزگىرىش بولۇشى مۇمكىن.
مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلات:
مائۇس قۇيرۇقى بىۋاسىتە PCR يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرى
ھايۋان توقۇلمىلىرى بىۋاسىتە PCR يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرى
يوللانغان ۋاقتى: 30-سېنتەبىردىن 2021-يىلغىچە
