باشلىنىش ماتېرىيالى: RNA

مىقدار تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى PCR (RT-qPCR) PCR تەجرىبىسىدە RNA نى دەسلەپكى ماتېرىيال سۈپىتىدە قوللانغان تەجرىبە ئۇسۇلى.بۇ خىل ئۇسۇلدا ، ئومۇمىي RNA ياكى خەۋەرچى RNA (mRNA) ئالدى بىلەن تەتۈر كۆچۈرۈلگەن تولۇقلىما DNA (cDNA) غا كۆچۈرۈلىدۇ.ئۇنىڭدىن كېيىن ، cDNA نى قېلىپ قىلىپ qPCR ئىنكاسى ئېلىپ بېرىلدى.RT-qPCR گېن ئىپادىلەش ئانالىزى ، RNA ئارىلىشىشنى دەلىللەش ، مىكرو ئېلېمېنتنى دەلىللەش ، كېسەللىك قوزغاتقۇچنى بايقاش ، گېن تەكشۈرۈش ۋە كېسەللىك تەتقىقاتى قاتارلىق كۆپ خىل مولېكۇلا بىئولوگىيىلىك قوللىنىشچان پروگراممىلاردا ئىشلىتىلگەن.

RT-qPCR ئۈچۈن بىر قەدەم ۋە ئىككى باسقۇچلۇق ئۇسۇل

RT-qPCR بىر باسقۇچ ياكى ئىككى باسقۇچلۇق ئۇسۇل ئارقىلىق ئەمەلگە ئاشىدۇ.بىر باسقۇچلۇق RT-qPCR تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە PCR كۈچەيتكۈچنى بىرلەشتۈرگەن بولۇپ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە DNA پولىمېراسى ئوخشاش بىر بۇففېر شارائىتىدا ئوخشاش تۇرۇبادىكى ئىنكاسنى تاماملىيالايدۇ.بىر قەدەملىك RT-qPCR پەقەت تەرتىپلىك خاسلىق ئىشلىتىشنىلا تەلەپ قىلىدۇ.ئىككى باسقۇچلۇق RT-qPCR دە ، ئوخشىمىغان ئەلالاشتۇرۇلغان بۇففېر ، ئىنكاس شارائىتى ۋە دەسلەپكى لايىھىلەش ئىستراتېگىيىسى قوللىنىلىپ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە PCR كۈچەيتىش ئىككى تۇرۇبىدا ئېلىپ بېرىلىدۇ.

مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (بىر قەدەم) -SYBR يېشىل I.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (بىر قەدەم) -تاكمان

RT Easyᵀᴹ مەن بىرىنچى دەرىجىلىك CDNA بىرىكتۈرۈشنىڭ ئۇستازى

ھەقىقىي ۋاقىت PCR Easyᵀᴹ-SYBR يېشىل I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

ئومۇمىي RNA ۋە mRNA نى تاللاش

RT-qPCR تەجرىبىسىنى لايىھىلىگەندە ، ئومۇمىي RNA ياكى ساپلاشتۇرۇلغان mRNA نى تەتۈر ترانسكرىپسىيەنىڭ قېلىپى قىلىپ ئىشلىتىشنى قارار قىلىش كېرەك.گەرچە mRNA سەل يۇقىرى سەزگۈرلۈك بىلەن تەمىنلىيەلەيدىغان بولسىمۇ ، ئومۇمىي RNA يەنىلا دائىم ئىشلىتىلىدۇ.بۇنىڭدىكى سەۋەب ، ئومۇمىي RNA نىڭ دەسلەپكى ماتېرىيال سۈپىتىدە mRNA غا قارىغاندا تېخىمۇ مۇھىم ئەۋزەللىكى بار.بىرىنچىدىن ، بۇ جەريان تېخىمۇ ئاز تازىلاش باسقۇچلىرىنى تەلەپ قىلىدۇ ، بۇ قېلىپنىڭ تېخىمۇ ياخشى مىقداردا ئەسلىگە كېلىشىگە ۋە كاتەكچە نومۇرىنى باشلاشنىڭ نەتىجىسىنىڭ تېخىمۇ نورماللىشىشىغا كاپالەتلىك قىلىدۇ.ئىككىنچىدىن ، ئۇ mRNA موللاش باسقۇچىدىن ساقلىنىدۇ ، بۇ ئوخشىمىغان mRNA نىڭ ئەسلىگە كېلىشى سەۋەبىدىن ئەگرى-توقاي نەتىجىنىڭ يۈز بېرىشىدىن ساقلىنالايدۇ.ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، كۆپىنچە قوللىنىشچان پروگراممىلاردا نىشانلىق گېننىڭ نىسپىي مىقدارلىشىشى بايقاشنىڭ مۇتلەق سەزگۈرلۈكىدىن مۇھىم بولغاچقا ، ئومۇمىي RNA كۆپىنچە ئەھۋاللاردا تېخىمۇ ماس كېلىدۇ.

تەتۈر ترانسكرىپسىيە قەغىزى

ئىككى باسقۇچلۇق ئۇسۇلدا ، ئوخشىمىغان ئۈچ خىل ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ cDNA ئىنكاسىنى باشلىغىلى بولىدۇ: oligo (dT) پىرىسلاش ماشىنىسى ، ئىختىيارى پىرىمېر ياكى تەرتىپكە ماس كېلىدىغان پىرىس.ئادەتتە ، ئولىگو (dT) پىرىسلىغۇچ ۋە ئىختىيارى پىرىمېرلار بىرلەشتۈرۈپ ئىشلىتىلىدۇ.بۇ پىرىمېرلار قېلىپ mRNA بەلبېغىغا تۇتىشىدۇ ھەمدە بىرىكمە باشلىنىش بىلەن تەتۈر كۆچۈرۈلمە تەمىنلەيدۇ.

تەتۈر كۆچۈرۈلمە

تەتۈر كۆچۈرۈلۈش بولسا RNA نى ئىشلىتىپ DNA نى بىرىكتۈرگۈچى ئېنزىم.بەزى تەتۈر كۆچۈرۈلگەن خاتىرىلەردە RNase پائالىيىتى بار بولۇپ ، كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن RNA-DNA ئارىلاشما بەلۋاغتىكى RNA تاللىرىنى تۆۋەنلىتىدۇ.ئەگەر ئۇنىڭدا RNase فېرمېنتلىق پائالىيىتى بولمىسا ، تېخىمۇ يۇقىرى qPCR ئۈنۈمى ئۈچۈن RNaseH نى قوشقىلى بولىدۇ.كۆپ ئىشلىتىلىدىغان فېرمېنت مولونېي مۇرىن ئاق قان كېسىلى ۋىرۇسىنىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈشى ۋە قۇش مېيلوبلاستوما ۋىرۇسىنىڭ تەتۈر كۆچۈرۈلۈشىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.RT-qPCR غا نىسبەتەن ئېيتقاندا ، تېخىمۇ يۇقىرى ئىسسىقلىق ساقلاش ئىقتىدارىغا ئىگە تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنى تاللاش ئەڭ كۆڭۈلدىكىدەك ئىش ، بۇنداق بولغاندا تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا cDNA بىرىكتۈرۈش ئېلىپ بېرىلىپ ، RNA نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلما بىلەن مۇۋەپپەقىيەتلىك ھالدا كۆچۈرۈلۈشىگە كاپالەتلىك قىلىش بىلەن بىر ۋاقىتتا ، پۈتۈن ئىنكاس جەريانىدا پۈتۈن پائالىيىتىنى ساقلاپ ، cDNA مەھسۇلات مىقدارى يۇقىرى بولىدۇ.

مۇناسىۋەتلىك مەھسۇلاتلار:

Foreasy M-MLV تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى

تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNase H پائالىيىتى

RNaseH RNA-DNA كۆپەيتمىسىدىن RNA نى تۆۋەنلىتىدۇ ، قوش لىنىيىلىك DNA نى ئۈنۈملۈك بىرىكتۈرەلەيدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، ئۇزۇن mRNA نى قېلىپ قىلىپ ئىشلەتكەندە ، RNA بالدۇر تۆۋەنلەپ كېتىشى مۇمكىن ، نەتىجىدە CDNA ئۈزۈلۈپ قالىدۇ.شۇڭلاشقا ، ئۇزۇن خاتىرىلەرنى بىرىكتۈرۈشنى ئويلىسىڭىز ، cDNA كلونلاش جەريانىدا RNaseH پائالىيىتىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش پايدىلىق.بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، RNase H پائالىيىتى بىلەن تەتۈر كۆچۈرۈلۈش كۆپىنچە qPCR قوللىنىشچان پروگراممىلىرىغا پايدىلىق ، چۈنكى ئۇلار PCR نىڭ بىرىنچى دەۋرىيلىكىدە RNA-DNA كۆپەيتمىسىنىڭ ئېرىشىنى كۈچەيتىدۇ.

دەسلەپكى لايىھە

RT-qPCR دىكى qPCR قەدەم باسقۇچىدا ئىشلىتىلگەن PCR پىرىسلىغۇچ ئەڭ ياخشىسى exon-exon ئۇلىنىشىنى كېڭەيتىش ئۈچۈن لايىھىلەنگەن بولۇشى كېرەك ، بۇ يەردە كۈچەيتكۈچ كۆرسەتكۈچى بەلكىم ئەمەلىي تاشقى چېگرانى كېسىپ ئۆتىشى مۇمكىن.ئىچكى قىسىمدىكى گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA تەرتىپلىرى كۈچەيتىلمىگەچكە ، بۇ لايىھە گېننىڭ DNA نى بۇلغاشتىن كۈچەيگەن يالغان ئاكتىپلارنىڭ خەۋپىنى تۆۋەنلىتىدۇ.

ئەگەر پرېرمېرلار exon ياكى exon-exon چېگراسىنى ئايرىپ لايىھەلەپ چىقالمىسا ، RNA ئەۋرىشكىسىنى RNase بولمىغان DNase I ياكى dsDNase ئارقىلىق داۋالاش ئارقىلىق گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA نىڭ بۇلغىنىشىنى يوقىتىش زۆرۈر بولۇشى مۇمكىن.

RT-qPCR كونترول

تەتۈر ترانسكرىپسىيە مەنپىي كونترول (-RT كونترول) بارلىق RT-qPCR تەجرىبىسىگە كىرگۈزۈلۈپ ، DNA نىڭ بۇلغىنىشىنى بايقاش كېرەك (مەسىلەن گېنتىكىلىق DNA ياكى ئىلگىرىكى ئىنكاسلاردىكى PCR مەھسۇلاتلىرى دېگەندەك).بۇ كونترول تەتۈر كۆچۈرۈلگەندىن باشقا بارلىق ئىنكاس تەركىبلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بۇ كونترول بىلەن تەتۈر كۆچۈرۈلۈش يۈز بەرمىگەچكە ، ئەگەر PCR كۈچەيتىلىشى كۆرۈلسە ، DNA نىڭ بۇلغىنىشى مۇمكىن.