بىز تەجرىبىلىك ئىشلەپچىقارغۇچى.بازارنىڭ مۇھىم ئېتىبار گۇۋاھنامىسىدە كۆپ قىسىمنى قولغا كەلتۈرۈش جۇڭگونىڭ يۇقىرى سەزگۈرلۈكى بىر قەدەملىك تەكشۈرۈش Rt-QpcrKit V2 ، سۈپەت زاۋۇتنىڭ ھاياتى ، خېرىدارلارنىڭ ئېھتىياجىغا ئەھمىيەت بېرىش شىركەتنىڭ مەۋجۇتلۇقى ۋە تەرەققىياتىنىڭ مەنبەسى ، بىز سەمىمىيلىك ۋە سەمىمىي خىزمەت پوزىتسىيىسىدە چىڭ تۇرىمىز ، كېلىشىڭىزنى ئۈمىد قىلىمىز!
بىز تەجرىبىلىك ئىشلەپچىقارغۇچى.ئۇنىڭ بازىرىدىكى ھالقىلىق گۇۋاھنامىلەردە كۆپ سانلىقنى قولغا كەلتۈرۈشجۇڭگو تاك DNA پولىمېراسى, Qpcrشىركىتىمىز ۋەدە بېرىدۇ: مۇۋاپىق باھا ، ئىشلەپچىقىرىش ۋاقتى قىسقا ۋە سېتىشتىن كېيىنكى قانائەتلىنەرلىك مۇلازىمەت ، بىز يەنە خالىغان ۋاقىتتا زاۋۇتىمىزنى زىيارەت قىلىشىڭىزنى قارشى ئالىمىز.ھازىر بىزنىڭ يېقىشلىق ۋە ئۇزۇن مۇددەتلىك سودىمىزنىڭ بولۇشىنى تىلەيمىز !!!

چۈشەندۈرۈش

بۇ يۈرۈشلۈك ئۈسكۈنىگە ئۆزگىچە لىز بۇففېر سىستېمىسى ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، RT-qPCR ئىنكاسى ئۈچۈن مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىدىن RNA نى تېزلىكتە قويۇپ بېرەلەيدۇ ، بۇ ئارقىلىق ۋاقىت ئىسراپچىلىقى ۋە جاپالىق RNA تازىلاش جەريانىنى يوقىتىدۇ.RNA قېلىپىنى پەقەت 7 مىنۇتتىلا ئېرىشكىلى بولىدۇ.يۈرۈشلۈك دېتال تەمىنلىگەن 5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسى ۋە 2 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاشما SYBR رېئاكتورى تېز سۈرئەتتە ئۈنۈملۈك PCR نەتىجىسىنى قولغا كەلتۈرەلەيدۇ.

5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسى ۋە 2 × بىۋاسىتە qPCR Mix-SYBR نىڭ كۈچلۈك چەكلىگۈچكە بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارى بار ، ئەۋرىشكىنىڭ لىزتىنى بىۋاسىتە RT-qPCR نىڭ قېلىپى قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدۇ.بۇ يۈرۈشلۈك زاپچاستا ئۆزگىچە RNA يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى Foregene تەتۈر كۆچۈرۈلگەن نۇسخىسى ۋە Hot D-Taq DNA پولىمېراسى ، DNTPs ، MgCl بار.₂، ئىنكاس قايتۇرغۇچ ، PCR ئەلالاشتۇرغۇچ ۋە تۇراقلاشتۇرغۇچ.

ئۆلچىمى

200 × 20μl Rxns ، 1000 × 20μl Rxns

يۈرۈشلۈك زاپچاسلار

ئالاھىدىلىكى ۋە ئەۋزەللىكى

■ ئاددىي ۋە ئۈنۈملۈك: Cell Direct RT تېخنىكىسى بىلەن RNA ئەۋرىشكىسىنى پەقەت 7 مىنۇتتىلا ئېرىشكىلى بولىدۇ.

Ample ئەۋرىشكە تەلىپى كىچىك ، 10 ھۈجەيرە تەكشۈرگىلى بولىدۇ.

■ يۇقىرى ئېقىمى: 384 ، 96 ، 24 ، 12 ، 6 قۇدۇق تاختىسىدا يېتىشتۈرۈلگەن ھۈجەيرىلەردە RNA نى تېزلا بايقىيالايدۇ.

■ DNA ئۆچۈرگۈچى قويۇپ بېرىلگەن گېننى تېزلىكتە چىقىرىپ تاشلاپ ، كېيىنكى تەجرىبە نەتىجىسىگە بولغان تەسىرىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلىتىدۇ.

■ ئەلالاشتۇرۇلغان RT ۋە qPCR سىستېمىسى ئىككى باسقۇچلۇق RT-PCR تەتۈر ترانسكرىپسىيەسىنى تېخىمۇ ئۈنۈملۈك ۋە PCR نى تېخىمۇ كونكرېتلاشتۇرىدۇ ، ھەمدە RT-qPCR ئىنكاس چەكلىگۈچكە تېخىمۇ چىداملىق.

Kit application

قوللىنىش دائىرىسى: مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەر.

- ئەۋرىشكە لايزىسى ئارقىلىق تارقىتىلغان RNA: پەقەت بۇ يۈرۈشلۈكنىڭ RT-qPCR قېلىپىغىلا ماس كېلىدۇ.

- بۇ زاپچاسنى تۆۋەندىكى مەقسەتلەردە ئىشلىتىشكە بولىدۇ: گېن ئىپادىلەش ئانالىزى ، siRNA ۋاسىتىلىك گېننىڭ سۈكۈت قىلىش ئۈنۈمىنى دەلىللەش ، دورا تەكشۈرۈش قاتارلىقلار.

دىئاگرامما

ساقلاش ۋە ساقلاش ئۆمرى

بۇ زاپچاسنىڭ I قىسمى 4 at دا ساقلىنىشى كېرەك.ئىككىنچى قىسىم -20 at دە ساقلىنىشى كېرەك.

Foregene Protease Plus II نى 4 at ساقلاش كېرەك ، -20 at دە توڭلىماڭ.

Reagent 2 × بىۋاسىتە qPCR Mix-SYBR نى قاراڭغۇدا -20 at ساقلاش كېرەك.ئەگەر دائىم ئىشلىتىلسە ، ئۇنى 4 at دە قىسقا مۇددەتلىك ساقلاشقا بولىدۇ (10 كۈن ئىچىدە ئىشلىتىش) .بىز تەجرىبىلىك ئىشلەپچىقارغۇچى.ئۇنىڭ بازاردىكى مۇھىم ئېتىبار گۇۋاھنامىسىدە كۆپ قىسىمنى قولغا كەلتۈرۈش جۇڭگو يۇقىرى سەزگۈرلۈك بىر قەدەملىك تەكشۈرۈش Rt-Qpcr Kit V2 ، سۈپەت زاۋۇتنىڭ ھاياتى ، خېرىدارلارنىڭ ئېھتىياجىغا ئەھمىيەت بېرىش شىركەتنىڭ مەۋجۇتلۇقى ۋە تەرەققىياتىنىڭ مەنبەسى ، بىز سەمىمىيلىك ۋە سەمىمىي خىزمەت پوزىتسىيىسىدە چىڭ تۇرىمىز ، كېلىشىڭىزنى ئۈمىد قىلىمىز!
چوڭ ئېتىبارجۇڭگو تاك DNA پولىمېراسى، Qpcr ، شىركىتىمىز ۋەدە بېرىدۇ: مۇۋاپىق باھا ، ئىشلەپچىقىرىش ۋاقتى قىسقا ۋە سېتىشتىن كېيىنكى قانائەتلىنەرلىك مۇلازىمەت ، بىز يەنە خالىغان ۋاقىتتا زاۋۇتىمىزنى زىيارەت قىلىشىڭىزنى قارشى ئالىمىز.ھازىر بىزنىڭ يېقىشلىق ۋە ئۇزۇن مۇددەتلىك سودىمىزنىڭ بولۇشىنى تىلەيمىز !!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -تاقan

Cat.No.DRT-01021/01022

كاتەكچە بىۋاسىتە RT-qPCR ئۈچۈن 1000،000 ≤ كاتەكچە ئىشلىتىلىدۇ

مەھسۇلات تونۇشتۇرۇش

بۇ مەھسۇلات ئۆزگىچە لىز بۇففېر سىستېمىسى ئارقىلىق RT-qPCR ئىنكاسى ئۈچۈن مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىدىن RNA نى تېزلىكتە قويۇپ بېرىدۇ ، ۋاقىت ئىسراپچىلىقى ۋە جاپالىق RNA تازىلاش جەريانىنى يوقىتىدۇ ، ھەمدە تەلەپ قىلىنغان RNA قېلىپىنى قولغا كەلتۈرۈشكە پەقەت 7 مىنۇتلا ۋاقىت كېتىدۇ ، بۇ زاپچاس تەمىنلىگەن 5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسى ، 2 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاشما تاقمان ھەقىقىي ۋە ئۈنۈملۈك ھالدا PCR نەتىجىسىنى قولغا كەلتۈرەلەيدۇ.

5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسى ۋە 2 × بىۋاسىتە qPCR Mix-Taqman نىڭ كۈچلۈك چەكلىگۈچكە بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارى بار بولۇپ ، قېلىپ سۈپىتىدە ئۆلچەنگەن ئەۋرىشكىنىڭ لىزاتىدىن پايدىلىنىپ ئۈنۈملۈك بۇرۇلۇش ۋە كونكرېت كۈچەيتكىلى بولىدۇ.رېئاكتور تەركىبىدە Foregene Reverse Transcriptase ، Hot D-Taq DNA Polymerase ، dNTPs ، MgCl قاتارلىقلار بار.₂، رېئاكسىيە بۇففېر ، PCR ئەلالاشتۇرغۇچ ۋە تۇراقلاشتۇرغۇچ ، لىز بۇففېر ئارقىلىق ئەۋرىشكىنى تېز ۋە ئاسان بايقىغىلى بولىدۇ ، ھەمدە يۇقىرى سەزگۈرلۈك ، خاسلىق ۋە مۇقىملىق ئالاھىدىلىكىگە ئىگە.

مەھسۇلات ئالاھىدىلىكى

ئاددىي ، ئۈنۈملۈك Cell Direct RT تېخنىكىسى RNA ئەۋرىشكىسىگە 7 مىنۇت ۋاقىت كېتىدۇ.

ئەۋرىشكە تەلىپى كىچىك ، تەجرىبە ئۈچۈن كەم دېگەندە 10 مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.

RNA نىڭ تېز سۈرئەتتە 384 ، 96 ، 24 ، 12 ۋە 6 قۇدۇق تەخسىسىگە ئوخشاش مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەرنى سېتىۋېلىشى.

DNA Eraser قويۇپ بېرىلگەن گېنلارنى تېزلىكتە چىقىرىپ تاشلاپ ، كېيىنكى تەجرىبە نەتىجىسىگە بولغان تەسىرىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلىتىدۇ.

ئەلالاشتۇرۇلغان RT ۋە qPCR سىستېمىسى تېخىمۇ ئۈنۈملۈك تەتۈر ترانسكرىپسىيە ، ئېنىقلىق ۋە تېخىمۇ كۈچلۈك RT-qPCR ئىنكاس چەكلىگۈچكە بەرداشلىق بېرەلەيدىغان ئىككى باسقۇچلۇق RT-PCR نى قوزغىتىدۇ.

Kit application

قوللىنىش دائىرىسى: مەدەنىيەتلىك ھۈجەيرىلەر.

ئەۋرىشكە lysis RNA نى شەرھلىدى: پەقەت ئىككى باسقۇچلۇق RT-qPCR قېلىپى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.

يۈرۈشلۈك دېتاللارنى تۆۋەندىكى مەقسەتلەردە ئىشلىتىشكە بولىدۇ: گېننى تەڭشەش ئىپادىسىنى ئانالىز قىلىش ، ئاللېنى تەكشۈرۈش ، دورا تەكشۈرۈش قاتارلىقلار.

يۈرۈشلۈك چەكلىمىسى

كۈچەيتىلگەن پارچىلار ≤ 300 bp.

يۈرۈشلۈك مەدەنىيەت يېڭى ھۈجەيرىلىرىگە ئىشلىتىلىدۇ.

مەھسۇلات سۈپىتىنى كونترول قىلىش

FOREGENE نىڭ ئومۇمىي سۈپەت باشقۇرۇش سىستېمىسىغا ئاساسلانغاندا ، ھەر بىر تۈركۈم Cell Direct RT-qPCR يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرى كۆپ قېتىم قاتتىق سىناق قىلىنىپ ، ھەر بىر يۈرۈش زاپچاسلارنىڭ سۈپىتىنىڭ ئىشەنچلىكلىكى ۋە مۇقىملىقىغا كاپالەتلىك قىلىنغان.

يۈرۈشلۈك مەزمۇنلار

*:Cell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman نى ئايرىم سېتىۋالغىلى بولىدۇ ، تەپسىلاتلار قوشۇمچە 1-بەتتە تەمىنلەنگەن (13-بەت).

ساقلاش شارائىتى

1. توشۇش شەرتى

تۆۋەن تېمپېراتۇرا مۇز بوغچىسى توشۇشنىڭ پۈتكۈل جەريانى ، زاپچاسنىڭ <4 ° C ھالەتتە بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىش.

2. ساقلاش شارائىتى

I قىسمىنى 4 سېلسىيە گرادۇس ، ئىككىنچى بۆلەكنى -20 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاڭ.

Foregene Protease Plus II نى ° C4 قا ساقلاش كېرەك ، -20 سېلسىيە گرادۇستا مۇزلىماسلىق كېرەك.

رېئاكتور 2 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاشما-تاقمان -20 سېلسىيە گرادۇستا ، ياكى 4 سېلسىيە گرادۇستا قىسقا مۇددەت ئىشلىتىشكە بولىدۇ (10 كۈن ئىچىدە).

يۈرۈشلۈك زاپچاس ئۇچۇرى

Buffer CL: ھۈجەيرە لىمفا رېئاكسىيەسى ئۈچۈن زۆرۈر بولغان مۇھىت بىلەن تەمىنلەيدۇ.

باففېر ST: كېيىنكى RT غا تەسىر قىلىشتىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، لىماتتىكى ئاكتىپ ماددىنى ئاخىرلاشتۇرىدۇ.

DNA ئۆچۈرگۈچ: DNA يوقىتىش ، كېيىنكى تەجرىبىلەردە گېننى يوقىتىشنىڭ تەسىرى.

5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسى: يۇقىرى RNA يېقىنلىقى Foregene تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى ، RNase ئىنگىبىتور ، DNTPs ، تۇراقلاشتۇرغۇچ ، كۈچەيتكۈچ ، ئەلالاشتۇرغۇچ ۋە تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: لىز بۇففېر ئارقا كۆرۈنۈشىدە ، ھۈجەيرىلەر لايلىنىپ يادرو كىسلاتاسىنى قويۇپ بېرىدۇ.

2 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاشما تاقمان: بۇ رېئاكتوردا Hot D-Taq DNA پولىمېراسى ، DNTPs ، MgCl بار.₂، ئىنكاس قايتۇرغۇچ ، PCR ئەلالاشتۇرغۇچ ۋە مۇقىملاشتۇرغۇچ.

20 × ROX پايدىلىنىش بوياق: ئادەتتە ABI ، Stratagene ۋە باشقا شىركەتلەرنىڭ Real Time PCR كۈچەيتىش ئەسۋابىدا ئىشلىتىلىدۇ ، ئۇ PCR دورا ئىشلىتىش خاتالىقى كەلتۈرۈپ چىقارغان PCR نەيچىسى بىلەن تۇرۇبا پەرقىنى تەڭشەشكە ئىشلىتىلىدۇ.ئوخشىمىغان ئەسۋابلارغا لازىملىق 20 × ROX پايدىلىنىش بوياق قويۇقلۇقى ئوخشىمايدۇ ، ئىشلەتكۈچى ئۇنى چالغۇنىڭ تەۋسىيە قىلىنغان قويۇقلۇقىغا ئاساسەن قوشالايدۇ.

RNase-Free ddH₂O: ئىككى باسقۇچلۇق RT-qPCR رېئاكسىيەسى ئۈچۈن RNase ھەقسىز سۈمۈرۈلگەن ئۇلترا ساپ سۇ.

ئالدىنى ئېلىش تەدبىرلىرى:(زاپچاسنى ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئالدىنى ئېلىش تەدبىرلىرىنى ئەستايىدىل ئوقۇپ چىقىڭ)

ئەۋرىشكىنىڭ ئۆز-ئارا بۇلغىنىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، سىناقنىڭ مەشغۇلات ئۇسۇلىغا دىققەت قىلىڭ.

تەجرىبە مۇھىتى ۋە قاچا-قۇچىلارنىڭ پاكىزلىقىغا دىققەت قىلىڭ ، RNase نىڭ بۇلغىنىشى ۋە RNA نىڭ بۇزۇلۇشىدىن ساقلىنىڭ.

يېڭى ياكى ياخشى ساقلانغان ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىنى ئېلىڭ ، قايتا-قايتا توڭلىتىلغان ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىنى ئىشلەتمەڭ.

5 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاشمىسى ، 2 × بىۋاسىتە qPCR ئارىلاش-تاقمان قايتا-قايتا توڭلىتىشتىن ساقلىنىشى كېرەك ، بولمىسا ئۇ تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ۋە PCR ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.

Preparationsئىلگىرىمەشغۇلات

بۇ زاپچاسنى ئىشلىتىشتىن بۇرۇن كۆرسەتمىنى ئەستايىدىل ئوقۇپ چىقىڭ.Cell Direct RT-qPCR يۈرۈشلۈكى ئاددىي ، قۇلايلىق ۋە مەشغۇلات سۈرئىتى تېز ، كۆرسەتمىلەر پۈتكۈل يۈرۈشلۈك زاپچاسلار ۋە ئۇنى قانداق ئىشلىتىش ھەققىدە تولۇق ئۇچۇر بىلەن تەمىنلەيدۇ.ئىشلىتىشتىن بۇرۇن زۆرۈر تەجرىبە ماتېرىياللىرى ۋە ئۈسكۈنىلىرىنى تەييارلاڭ.

تەجرىبە ماتېرىياللىرى ۋە ئۈسكۈنىلىرى

Cell مەدەنىيەت ھۈجەيرىلىرى.

◆ 1.5 مىللىلىتىر ياكى 2 مىللىلىتىر ، RNase- / DNase-free centrifuge تۇرۇبىسى ، RNase- / DNase-Free ، 0.2 مىللىلىتىرلىق qPCR تۇرۇبىسى.

◆ qPCR ماشىنىسى ، تۇرۇبا ، تاختا كومپيۇتېر مەركەزدىن قاچۇرۇش (≥13,400×g) (تەجرىبە ئېھتىياجىغا ئاساسەن) قاتارلىقلار.

بىخەتەرلىك

◆ بۇ مەھسۇلات پەقەت ئىلمىي تەتقىقات ئۈچۈنلا ئىشلىتىلىدۇ ، ئۇنى دورا ، كلىنىكىلىق ، يېمەكلىك ۋە گىرىم بۇيۇملىرى ئۈچۈن ئىشلەتمەڭ.

Chemical خىمىيىلىك بۇيۇملارنى ئىشلەتكەندە ، مۇۋاپىق تەجرىبىخانا كىيىمى ، پەلەي ، قوغداش كۆزئەينىكى قاتارلىقلارنى كىيىڭ.

مەشغۇلاتيېتەكچى

Cell Lysis سىستېمىسى ، RT سىستېمىسى ۋە qPCR رېئاكسىيە ھەل قىلىش قوشۇمچە زاپچاسلىرىنى قوشۇمچە سېتىۋالغىلى بولىدۇ ، قوشۇمچە ماتېرىيال 1 (13-بەت).

مەشغۇلات قوللانمىسى

جاۋاب: ئەۋرىشكە RNA نىڭ تارقىتىلىشى

1. ھۈجەيرىلەر ئالدىنئالا ياسالغان: ھۈجەيرە مەدەنىيەت تاختىسىنى سوغۇق PBS بىلەن يۇيۇڭ ، ئاندىن ھۈجەيرىلەرنى لايلاڭ (10-10)⁶), 10⁶ ھۈجەيرىلەرنىڭ مىقدارىغا قارىغاندا ، RNA ئېلىش ۋە ساپلاشتۇرۇش ئۈچۈن ھۈجەيرىگە RNA ئايرىپ ساقلاش ئومۇمىي سانى (DE-03111) ياكى ھايۋانلارنىڭ ئومۇمىي RNA ئايرىۋېتىش زاپچىسى (DE-03011) تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

1.1.يېپىشقاق ھۈجەيرىلەر (24- قۇدۇق تەخسىسى)

1.1.1.ھەر بىر قۇدۇقتىكى ھۈجەيرىلەرنىڭ سانىنى ئېنىقلاپ ، ھۈجەيرىلەرنىڭ سانىنىڭ 1 × 10 ئىكەنلىكىنى جەزملەشتۈرۈڭ⁵ھەمدە تۇرۇبا ئىشلىتىپ مەدەنىيەت ۋاستىسىدىن مەدەنىيەت ۋاسىتىسىنى چىقىرىۋېتىڭ.

1.1.2.ھەر بىر قۇدۇققا 200 μl ئالدىن سوۋۇتۇلغان 1 × PBS قوشۇڭ.قايتا-قايتا تۇرۇبا چىقارماڭ ھەمدە قۇدۇقتىن PBS نى ئېلىۋەتمەڭ.تەخسىنى يانتۇ قىلىپ ، ئامال بار PBS نى ئېلىڭ.2-باسقۇچقا قەدەم قويۇڭ.

1.1.3.ھۈجەيرە يۇيۇش سۇيۇقلۇقىغا ئوخشىمىغان ھۈجەيرە مەدەنىيەت تامىقى ياكى پايدىلىنىش نومۇرى جەدۋىلى 1-1 قوشۇلدى.

جەدۋەل 1-1: ئوخشىمىغان ساندىكى ھۈجەيرىلەرنىڭ PBS مىقدارى

دىققەت：مۇستەھكەم يېپىشقاق ھۈجەيرىگە كاپالەتلىك قىلىش，يۇيغاندا نۇرغۇن ھۈجەيرە يوقىتىشتىن ساقلانغان.

1.2.ئاسما ھۈجەيرىلەر ياكى يېپىشقاق ھۈجەيرىلەر يىرىڭلىق تەخسىلەردە يېتىلدۈرۈلگەن

1.2.1.كۆپ بولمىغان قۇدۇق تاختىسىدا يېتىشتۈرۈلگەن يېپىشقاق ھۈجەيرىلەر (ئاسما ھۈجەيرىلەر كېيىنكى قەدەم 1.2.2 دىن باشلىنىدۇ) ، نورمال ھۈجەيرىلەرنى يىغىش ئۇسۇلى بويىچە ھۈجەيرىلەرنى يىغىدۇ ۋە ئايرىپ ، ئۇلارنى مەدەنىيەت تاختىسى ياكى مەركەزدىن قاچۇرۇش نەيچىسىگە قويىدۇ.ئەگەر trypsinization ئىشلىتىلگەن بولسا ، مەركەزلەشتۈرۈش ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنى يىغىش ۋە قالدۇق ترىپسىننى ئېلىۋېتىشنى تەلەپ قىلىڭ ، PBS توختىتىلغان ھۈجەيرىلەرنى ئايرىم ھۈجەيرىلەرگە قوشۇپ ھۈجەيرىلەرنى تارقاقلاشتۇردى.

1.2.2.ھۈجەيرىلەرنىڭ سانى سانالغاندىن كېيىن ، تەقلىد قىلىنغان ھۈجەيرىلەر 1 × 10⁵ بىرىدىن سېنترىفۇگ تۇرۇبىسى ، 1000 × g دە 10 مىنۇتتا مەركەزلەشتۈرۈش ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنى يىغىڭ.

1.2.3.مەركەزدىن قاچۇرۇش نەيچىسىگە 200 مىللىمېتىرلىق PBS نى قوشۇڭ ، قايتا-قايتا تۇرۇبا يوللىماڭ ھەمدە PBS نى بىۋاسىتە ئارزۇ قىلىڭ.2-قەدەمگە قەدەم قويۇڭ (ئەگەر چۆكۈش تەس بولۇپ ، ھۈجەيرىلەر قايتا توختىتىلغان بولسا ، خاسىيەتلىك كېمىنى تاشلىۋەتكەندىن كېيىن 10 مىنۇتتا 1000 × گرام مەركەزدىن قاچۇرۇلسا بولىدۇ ، ھۈجەيرە پېلەك 2-قەدەمگە قەدەم قويىدۇ)

2.Cell lysis: Buffer CL نى ئېلىۋېتىڭ ، ئۇنىڭ تېمپېراتۇرىسى ئۆي تېمپېراتۇرىسى ، DNA Eraser ۋە Foregene Protease Plus II بىلەن تەڭلەشتى ، تۆۋەندىكى جەدۋەل 1-2 تەييارلانغان لىز سىستېمىسىغا ئاساسەن: (Lysis ئېرىتمىسى ئىشلىتىشكە تەييار).

جەدۋەل 1-2: تازىلاش سىستېما تەييارلىقى (ئەسكەرتىش: مۇز ئۈستىدىكى تەييارلىقتا)

3..

دىققەت：كۆپۈكلەرنىڭ شەكىللىنىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، تۇرۇبا تۇرۇبىسىنىڭ ئۆلچىمى 200 مىللىمېتىر ياكى ئۇنىڭدىن تۆۋەن تەڭشەلگەندە.ھۈجەيرىلەر لىزدىن كېيىن بۇلۇتلۇق كۆرۈنۈشى مۇمكىن ، بۇ نورمال ئەھۋال.

4. (24 - ياخشى تەخسە مىسال) سۇيۇقلۇق 20 مىللىمېتىرلىق بۇففېر ST (1-3 جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن مىقداردا ئوخشىمىغان لىز سىستېمىسى Buffer ST قوشۇلدى) ، 5-10 قېتىم قايتا-قايتا تۇرۇبا يولى ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (20-25 ℃) 2 مىنۇت سىلىندى.

دىققەت：تۇرۇبا ئۇچى يەر يۈزىگە بىر تەرەپ قىلىنغان بولۇپ ، لىزاتنىڭ قوشۇلۇشىغا كاپالەتلىك قىلىنغان，كۆپۈكنىڭ شەكىللىنىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، تۇرۇبا تۇرۇبىسىنىڭ ئۆلچىمى 200 مىللىمېتىر ياكى ئۇنىڭدىن تۆۋەن تەڭشەلگەندە.

جەدۋەل 1-3：Buffer ST نى قوشۇڭ

5. لىزات كېيىنكى RT-qPCR تەجرىبىسىگە ئىشلىتىلىدۇ.ئەگەر كېيىنكى سىناقلارنى ۋاقتىدا ئېلىپ بارغىلى بولمىسا ، ئۇنى مۇزدا 2 سائەتتىن ئېشىپ كەتمەسلىكى ، -20 ℃ ياكى -80 at (ئۈچ ئايدىن ئېشىپ كەتمەسلىكى) نى ساقلاڭ.

B: RT سىستېمىسى تەييارلىقى

1. 5 × بىۋاسىتە RT ئارىلاشمىسىنى چىقىرىپ مۇز مۇنچىسىغا قويۇڭ ، تەبىئىي ئېرىپ ، ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇپ كېيىن ئىشلىتىڭ.RNase-Free ddH2O نى چىقىرىپ ئېرىتىپ مۇز مۇنچىسىغا قويۇپ كېيىن ئىشلىتىڭ.تۆۋەندىكى 2-1 جەدۋەلگە ئاساسەن مۇز ئۈستىدىكى ئىنكاس سىستېمىسىنى تەييارلاڭ.

2-1 جەدۋەل: RT رېئاكسىيە سىستېمىسىنىڭ تەييارلىقى

2. سىستېما تۈزۈش تاماملانغاندىن كېيىن ، ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇلۇپ ، تۆۋەندىكى جەدۋەلدە 2 -2 ئىنكاس شارائىتىدا RT ئىنكاسى بار.

2-2 جەدۋەل: RT رېئاكسىيە شەرتى تەڭشىكى

3. ئىنكاس تاماملانغاندىن كېيىن ، ئىنكاس مەھسۇلاتى qPCR ئۈچۈن بىۋاسىتە مۇزغا قويۇلدى ، ئۇزۇن مۇددەتلىك قوغداش -20 ℃ ياكى -80 put نى قويۇڭ.

ئەسكەرتىش: ساپلاشتۇرۇلمىغان قېلىپ ئىشلىتىلگەنلىكتىن ، تەتۈر كۆچۈرۈلگەن مەھسۇلاتتا ئاق چۆكمە پەيدا بولۇشى مۇمكىن.بۇ بىر نورمال ھادىسە.كېيىنكى سىناقلار ئۈچۈن خاسىيەتلىك ئادەمنى دەرھال مەركەزلەشتۈرۈڭ.

بۇنىڭدىن كېلىپ چىققان RT ئىنكاس ھەل قىلىش چارىسى كېيىنكى قەدەمدىكى ھەقىقىي ۋاقىت PCR ئىنكاس سىستېمىسىغا قوشۇلدى ، ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ% 10 دىن% 30 گىچە بولغان مىقدارنى قوشۇش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

C: qPCR ئىنكاس سىستېمىسى تەييارلاش

1. مۇۋاپىق مىقداردىكى B باسقۇچلۇق cDNA قېلىپىدا تۆۋەندىكى جەدۋەل 3-1 بويىچە تەييارلانغان ئىنكاس سىستېمىسى تەييارلىنىدۇ.

ئەسكەرتىش: cDNA قېلىپنىڭ مىقدارى qPCR سىستېمىسىنىڭ% 10-30 نى ئىگىلەيدۇ.مەسىلەن ، 20μl qPCR سىستېمىسىغا 2-6 مىللىمېتىر لىك لىزلىق بۇففېر قوشۇڭ ، ئەمما 6 مىللىمېتىردىن ئېشىپ كەتمەيدۇ.

2. qPCR ئىنكاسى ئۈچۈن ياخشى qPCR شارائىتى (Annealing temperature ， قاتارلىقلار) ئەلالاشتۇرۇش (3-2 جەدۋەلدە بېرىلگەن ئىنكاس شارائىتى).

ئەسكەرتىش: تېخىمۇ ياخشى نەتىجىگە ئېرىشىش ئۈچۈن qPCR ئىنكاسى ئۈچۈن ئەلالاشتۇرۇلغان شەرتلەرنى ئىشلىتىپ بېقىڭ.

3-1 جەدۋەل: PCR ئىنكاس سىستېمىسىنىڭ تەييارلىنىشى

1 *: دەسلەپكى ئىنكاس قايتۇرۇش ئىقتىدارى ناچار بولغاندا ، دەسلەپكى قويۇقلۇقى 50-900 nM ئارىلىقىدا تەڭشىلىدۇ.

ئەسكەرتىش: qPCR سىستېمىسىنى تەجرىبە ئېھتىياجى ۋە فلۇئورېسسېنسىيە ۋېلىسىپىت مودىلىغا ئاساسەن تەڭشىگىلى بولىدۇ.50 دىكى qPCR ئۈچۈنμl سىستېمىسى ، رېئاكتىپ مىقدارىنى 20 گە ئاساسەن مۇۋاپىق تەڭشەڭμl system.

2 *: فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدار ئىسسىقلىق دەۋرىيلىكىگە ئاساسەن ROX پايدىلىنىش بوياقنىڭ مۇۋاپىق ئاخىرقى قويۇقلۇقىنى تاللاڭ.ئادەتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار ۋېلىسىپىت مىنىشنىڭ ئەڭ مۇۋاپىق ROX پايدىلىنىش بوياق قويۇقلۇقى تۆۋەندىكى جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى:

3-2 جەدۋەل: qPCR ئىنكاس شارائىتى تەمىنلەندى

ئەسكەرتىش: ئەڭ ياخشى qPCR ئېففېكتىغا ئېرىشىش ئۈچۈن ، ئاستا-ئاستا PCR ئارقىلىق ئوخشىمىغان قېلىپلار ۋە ئوخشىمىغان پىرىسلارنىڭ ئىنكاس شارائىتىنى ئەلالاشتۇرغىلى بولىدۇ.PCR نىڭ رېئاكسىيە شارائىتى فلۇئورېسسېنسىيە ئانالىزچىسى ، قېلىپ ، پىرىسلاش قاتارلىقلارغا ئاساسەن ئوخشاش بولمايدۇ ، كونكرېت مەشغۇلاتتا ، ئەڭ ياخشى ئىنكاس شارائىتىنى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار ئىسسىقلىق ۋېلىسىپىت مىنىشنىڭ كونكىرىت شارائىتى ، قېلىپ تىپى ، قىزىقىش بۆلەكلىرىنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى ، كۈچەيتىلگەن بۆلەكنىڭ ئاساسى تەرتىپى ۋە GC مەزمۇنى ۋە پىرىمېرلارنىڭ ئۇزۇنلۇقى قاتارلىقلارغا ئاساسەن لايىھىلەش كېرەك.

ھەقىقىي ۋاقىت PCR دەسلەپكى لايىھىلەش پرىنسىپى

ئالغا ئىلگىرىلەش ۋە تەتۈر يۆنىلىشلىك كۆرسەتكۈچ

Real Time PCR ئۈچۈن دەسلەپكى لايىھىلەش ئىنتايىن مۇھىم.باشلانغۇچلار PCR كېڭەيتىشنىڭ كونكرېتلىقى ۋە ئۈنۈمى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، تۆۋەندىكى پرىنسىپلارغا ئاساسەن لايىھىلىگىلى بولىدۇ:

◆ دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى: 18-30bp.

◆ GC مەزمۇنى:% 40-60.

◆ Tm قىممىتى: Primer 5 گە ئوخشاش دەسلەپكى لايىھىلەش يۇمشاق دېتالى دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ Tm قىممىتىنى بېرەلەيدۇ.يۇقىرى ئېقىن ۋە تۆۋەن ئېقىندىكى Tm قىممىتى ئىمكانقەدەر يېقىن بولۇشى كېرەك.Tm ھېسابلاش فورمۇلاسىنى ئىشلىتىشكە بولىدۇ: Tm = 4 ° C (G + C) + 2 ° C (A + T).PCR ئىجرا قىلغاندا ، تېمپېراتۇرا ° C5 تىن تۆۋەن تېمپېراتۇرا ئادەتتە تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى قىلىپ تاللىنىدۇ (تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنىڭ ماس ھالدا ئۆسۈشى PCR ئىنكاسىنىڭ خاسلىقىنى ئاشۇرالايدۇ).

◆ Primers and PCR products:

Prim دەسلەپكى لايىھىلەش PCR كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى ئەڭ ياخشىسى 100-150bp.

The قېلىپنىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلما رايونىدىكى لايىھەلىگۈچىلەر ئىمكانقەدەر ساقلىنىش كېرەك.

Up يۇقىرى ئېقىن ۋە تۆۋەنكى ئېقىننىڭ 3 ′ ئۇچى ئارىسىدا 2 ياكى ئۇنىڭدىن ئارتۇق تولۇقلاش ئاساسى شەكىللىنىشتىن ساقلىنىڭ.

◆ Primer 3 ′ تېرمىنال ئاساسى ئۇدا 3 G ياكى C بىلەن بىللە بولمايدۇ.

◆ پىرىمېرلارنىڭ ئۆزىدە قوشۇمچە قۇرۇلما بولالمايدۇ ، بولمىسا چاچ ياساش قۇرۇلمىسى شەكىللىنىپ ، PCR نىڭ كۈچىيىشىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.

◆ ATCG دەسلەپكى قەدەمدە ئىمكانقەدەر تەكشى تەقسىملىنىشى ، 3 ′ تېرمىنال بازىسىدىن T دەپ ساقلىنىش كېرەك.

قوشۇمچە1：Cell DirectRT-qPCR Kit component تولۇقلىما بولىقى

1. Cell Lysis Solution