ھەممىگە ئايانكى ، مەركىزى دوگمىدا RNA DNA بىلەن ئاقسىلنىڭ ئىپادىلىنىشى ئوتتۇرىسىدىكى ترانسكرىپسىيە ۋاسىتىچىسى.DNA نى بايقاشقا سېلىشتۇرغاندا ، RNA نىڭ بايقىلىشى جانلىقلارنىڭ گېن ئىپادىسىنى تېخىمۇ ئوبيېكتىپ ئەكىس ئەتتۈرەلەيدۇ.RNA نى ئۆز ئىچىگە ئالغان تەجرىبىلەر تۆۋەندىكىلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ: qRT-PCR ، RNA-Seq ۋە بىرىكىش گېنىنى بايقاش قاتارلىقلار RNA نىڭ ئالاھىدىلىكىگە ئاساسەن (RNA نىڭ شېكەر ھالقىسى DNA نىڭ شېكەر ھالقىسىغا قارىغاندا تېخىمۇ كۆپ ھەقسىز گىدروكسىل گۇرۇپپىسىغا ئىگە) ، مۇھىتتىكى نۇرغۇن RNase بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ، RNA DNA غا قارىغاندا تېخىمۇ تۇراقسىز ۋە ناچارلىشىش ئاسان.ئەخلەتلەر ، ئەخلەتلەر ، ئەگەر RNA نىڭ سۈپىتى ياخشى بولمىسا ، ئۇنداقتا تەجرىبە نەتىجىسى چوقۇم قانائەتلىنەرلىك بولماسلىقى كېرەك ، بۇ ئېنىق بولمىغان سانلىق مەلۇمات ياكى تەكرارلىنىشنىڭ ياخشى بولماسلىقى سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ.شۇڭلاشقا ، RNA نى بىر تەرەپ قىلىشقا تېخىمۇ ئەھمىيەت بېرىش كېرەك ، كېيىنكى تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ توغرىلىقى ۋە توغرىلىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن سۈپەت كونترول قىلىش ئۇلىنىشىمۇ تېخىمۇ مۇھىم.

RNA نىڭ سۈپىتىنى كونترول قىلىش ئۈچۈن ، ئادەتتە كۆپ ئىشلىتىلىدىغان ئۇسۇللار بار:

• Spectrophotometry
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR
• كۇبىت فلۇئورېسسېنسىيە بوياش ئۇسۇلى

01 Spectrophotometry

RNA قوش زايومنى تۇتاشتۇردى ، دولقۇن ئۇزۇنلۇقى 260nm.لامبېرت-پىۋا قانۇنىغا ئاساسەن ، بىز RNA قويۇقلۇقىنى سۈمۈرۈلۈش چوققىسىدىن 260nm غا ھېسابلىيالايمىز.بۇنىڭدىن باشقا ، بىز يەنە RNA نىڭ ساپلىقىنى 260nm ، 280nm ۋە 230nm سۈمۈرۈلۈش چوققىسىنىڭ نىسبىتىگە ئاساسەن ھېسابلىيالايمىز.280nm ۋە 230nm ئايرىم-ئايرىم ھالدا ئاقسىل ۋە كىچىك مولېكۇلانىڭ سۈمۈرۈلۈش چوققىسى.لاياقەتلىك RNA ساپلىقىنىڭ A260 / A280 ۋە A260 / A230 نىڭ نىسبىتى 2 دىن يۇقىرى بولۇشى كېرەك. ئەگەر 2 گە يەتمىسە ، بۇ RNA ئەۋرىشكىسىدە ئاقسىل ياكى كىچىك مولېكۇلانىڭ بۇلغىنىشىدىن دېرەك بېرىدۇ ، ئۇنى قايتا تازىلاش كېرەك.بۇلغىنىش مەنبەسى تۆۋەن ئېقىندىكى سىناقلارغا تەسىر كۆرسىتىدۇ ، مەسىلەن PCR ئىنكاسىنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى تورمۇزلاش ، مىقدارنىڭ توغرا بولماسلىقى.RNA نىڭ ساپلىقى كېيىنكى نەتىجىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ ، شۇڭا سپېكترو فوتومېتىر ئادەتتە يادرو كىسلاتا تەجرىبىسىنىڭ بىرىنچى قەدىمىدە كەم بولسا بولمايدىغان سۈپەت كونترول ئۇلىنىشى.

رەسىم 1. تىپىك RNA / DNA سۈمۈرۈلۈش سپېكترى

02 ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى

ساپلىقتىن باشقا ، RNA نىڭ مۇكەممەللىكىمۇ RNA نىڭ سۈپىتىگە ھۆكۈم قىلىشنىڭ مۇھىم كۆرسەتكۈچلىرىنىڭ بىرى.RNA نىڭ ناچارلىشىشى ئەۋرىشكىدە نۇرغۇن قىسقا پارچىلارنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، شۇڭا ئۈنۈملۈك بايقاش ۋە پايدىلىنىش تەرتىپى بىلەن قاپلىغىلى بولىدىغان RNA پارچىلىرى سانى ئازىيىدۇ.RNA نىڭ پۈتۈنلۈكىنى% 1 لىك ئاگاروزا گېلىدىكى ئومۇمىي RNA نىڭ ئېلېكترو فورمىسى ئارقىلىق تەكشۈرگىلى بولىدۇ.بۇ ئۇسۇل گېلىنى ئۆزىڭىز تەڭشىيەلەيدۇ ياكى ئالدىن ياسالغان E-Gel ™ سىستېمىسىنى ئىشلىتىپ پۈتۈنلۈكىنى سىنايدۇ.ئومۇمىي RNA نىڭ% 80 تىن كۆپرەكى رىبوسومال RNA بولۇپ ، كۆپىنچىسى 28S ۋە 18S rRNA (سۈت ئەمگۈچىلەر سىستېمىسىدا) دىن تەركىب تاپقان.ياخشى سۈپەتلىك RNA ئىككى روشەن يورۇق بالداقنى كۆرسىتىدۇ ، بۇلار ئايرىم-ئايرىم ھالدا 5 Kb ۋە 2 Kb ، 28S ۋە 18S لىق يورۇق تاياقچە ، بۇ نىسبەت 2: 1 گە يېقىنلىشىدۇ.ئەگەر ئۇ تارقاق ھالەتتە بولسا ، بۇ RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ بۇزۇلغانلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ ، كېيىن تەسۋىرلەنگەن ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ RNA نىڭ سۈپىتىنى يەنىمۇ سىناش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

رەسىم 2. ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېزىدىكى بۇزۇلغان (2-يول) ۋە مۇكەممەل RNA (3-يول) نى سېلىشتۇرۇش.

03 Agilent Bioanalyzer

يۇقىرىدا بايان قىلىنغان ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېز ئۇسۇلىدىن باشقا ، بىز RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى ئاددىي ۋە تېز تونۇشىمىزغا ياردەم بېرەلەيمىز ، بىز يەنە Agilent بىيو ئانالىزلىغۇچ ئارقىلىق RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى بەلگىلىيەلەيمىز.ئۇ مىكرو مىقدارلىق سۇيۇقلۇق ، قىل قان تومۇر ئېلېكتىرو فورمىسى ۋە فتور فېرمېنسىيىسىدىن پايدىلىنىپ RNA نىڭ قويۇقلۇقى ۋە پۈتۈنلۈكىنى باھالايدۇ.ئىچىگە ئورۇنلاشتۇرۇلغان ئالگورىزىم ئارقىلىق RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ ئارخىپىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق ، Agilent بىيو ئانالىزچىسى پايدىلىنىش قىممىتى RNA مۇكەممەللىكى قىممىتى ، RNA پۈتۈنلۈكى نومۇرى (تۆۋەندە قىسقارتىلىپ RIN دېيىلىدۇ) نى ھېسابلىيالايدۇ.RIN نىڭ قىممىتى قانچە چوڭ بولسا ، RNA نىڭ مۇكەممەللىكى شۇنچە يۇقىرى بولىدۇ (1 ئىنتايىن ناچارلاشقان ، 10 بولسا ئەڭ مۇكەممەل).RNA غا مۇناسىۋەتلىك بەزى تەجرىبىلەر RIN نى سۈپەت باھالاشنىڭ پارامېتىرى قىلىپ ئىشلىتىشنى ئوتتۇرىغا قويدى.يۇقىرى ئۈنۈملۈك تەرتىپكە سېلىش تەجرىبىسىنى مىسالغا ئالساق (تۆۋەندە NGS دېيىلىدۇ) ، تېرمو فىشېرنىڭ ئونكومىن تاختىسىدىكى B ھۈجەيرە ۋە T ھۈجەيرە ئانتىگېن قوبۇللىغۇچىسىنى بايقاشقا ئىشلىتىلىدىغان Oncomine ™ ئىنسانلارنىڭ ئىممۇنىتېت رېپېرتېرىنىڭ كۆرسەتمىسى ، RIN قىممىتى 4 دىن يۇقىرى ، تېخىمۇ ئۈنۈملۈك ئوقۇش ۋە كلونلارنى ئۆلچەشكە بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (3-رەسىم).ئوخشىمىغان تاختىلارنىڭ ئوخشىمىغان تەۋسىيە دائىرىسى بار ، ھەمىشە تېخىمۇ يۇقىرى RIN تېخىمۇ ئۈنۈملۈك سانلىق مەلۇمات ئېلىپ كېلىدۇ.

3-رەسىم ، Oncomine ™ ئىنسانلارنىڭ ئىممۇنىتېت repertoire تەجرىبىسىدە ، RIN نىڭ 4 دىن يۇقىرى ئەۋرىشكىسى تېخىمۇ ئۈنۈملۈك ئوقۇش ۋە T ھۈجەيرە كلونلىرىنى بايقىيالايدۇ.【2】

قانداقلا بولمىسۇن ، RIN قىممىتىنىڭمۇ بەزى چەكلىمىلىرى بار.گەرچە RIN نىڭ NGS تەجرىبە سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ سۈپىتى بىلەن يۇقىرى مۇناسىۋىتى بولسىمۇ ، ئەمما FFPE ئەۋرىشكىسىگە ماس كەلمەيدۇ.FFPE ئەۋرىشكىسى ئۇزۇندىن بۇيان خىمىيىلىك بىر تەرەپ قىلىنغان بولۇپ ، ئېلىنغان RNA نىڭ ئادەتتە RIN قىممىتى بىر قەدەر تۆۋەن.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ سىناقنىڭ ئۈنۈملۈك سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ چوقۇم رازى بولمايدىغانلىقىنى بىلدۈرمەيدۇ.FFPE ئەۋرىشكىسىنىڭ سۈپىتىنى توغرا باھالاش ئۈچۈن ، RIN دىن باشقا ئۆلچەمنى ئىشلىتىشىمىز كېرەك.RIN دىن باشقا ، Agilent bioanalyzer يەنە RNA سۈپىتىنىڭ باھالاش پارامېتىرى سۈپىتىدە DV200 قىممىتىنى ھېسابلىيالايدۇ.DV200 بولسا RNA ئەۋرىشكىسىدىكى 200 bp دىن چوڭ پارچىلارنىڭ نىسبىتىنى ھېسابلايدىغان پارامېتىر.DV200 بولسا RFP غا قارىغاندا FFPE ئەۋرىشكە سۈپىتىنىڭ ياخشى كۆرسەتكۈچىسى.FFPE تەرىپىدىن ئېلىنغان RNA غا نىسبەتەن ، ئۇنىڭ ئۈنۈملۈك بايقىغىلى بولىدىغان گېن سانى ۋە گېننىڭ كۆپ خىللىقى بىلەن ئىنتايىن يۇقىرى مۇناسىۋىتى بار [3].گەرچە DV200 گەرچە FFPE نىڭ سۈپىتىنى بايقاشتىكى يېتەرسىزلىكلەرنى تولۇقلىيالايدىغان بولسىمۇ ، ئەمما Agilent بىيو ئانالىزچىسى يەنىلا RNA ئەۋرىشكىسىدىكى سۈپەت مەسىلىلىرىنى ئەتراپلىق تەھلىل قىلالمايدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە ئەۋرىشكە تەركىبىدە چەكلىگۈچ بار-يوقلۇقىمۇ بار.چەكلىگۈچنىڭ ئۆزى تۆۋەن ئېقىندىكى سىناقلارنىڭ كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىپ ، پايدىلىق سانلىق مەلۇماتلارنىڭ مىقدارىنى ئازايتالايدۇ.ئەۋرىشكىدە چەكلىگۈچ بار-يوقلۇقىنى بىلىش ئۈچۈن ، بىز كېيىنكى تەسۋىرلەنگەن ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR ئۇسۇلىنى قوللانساق بولىدۇ.

04 ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR

ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR ئۇسۇلى ئەۋرىشكەدىكى چەكلىگۈچنى بايقاپلا قالماي ، FFPE ئەۋرىشكىسىدىكى RNA نىڭ سۈپىتىنىمۇ توغرا ئەكىس ئەتتۈرىدۇ.Agilent بىئولوگىيىلىك ئانالىزچىلىرىغا سېلىشتۇرغاندا ، ھەقىقىي فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار ئەسۋابلىرى كەڭ قوللىنىلغانلىقى ئۈچۈن ئاساسلىق بىئولوگىيىلىك تەجرىبىخانىلاردا تېخىمۇ ئالقىشقا ئېرىشتى.RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ سۈپىتىنى سىناش ئۈچۈن ، بىز پەقەت GUSB (مۈشۈك نومۇرى Hs00939627) غا ئوخشاش ئىچكى پايدىلىنىش گېنى ئۈچۈن دەسلەپكى تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى سېتىۋېلىشىمىز ياكى تەييارلىشىمىز كېرەك.بۇ بىر يۈرۈش پىرىمېر ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى ۋە ئۆلچىمى (مەلۇم قويۇقلۇقتىكى ئومۇمىي RNA) ئارقىلىق مۇتلەق مىقدار تەجرىبىسى ئېلىپ بېرىش ئارقىلىق ، ئۈنۈملۈك RNA پارچىسىنىڭ قويۇقلۇقى RNA سۈپىتىنىڭ باھالاش ئۆلچىمى (قىسقا RNA فۇنكسىيەسى).NGS سىنىقىدا ، RNA ئەۋرىشكىسىنىڭ FRQ نىڭ ئۈنۈملۈك سانلىق مەلۇمات مىقدارى بىلەن ناھايىتى يۇقىرى باغلىنىشلىق ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق.0.2ng / uL FRQ دىن چوڭ بولغان بارلىق ئەۋرىشكەلەرگە نىسبەتەن ، كەم دېگەندە% 70 ئوقۇشلۇق پايدىلىنىش تەرتىپىنى ئۈنۈملۈك قاپلىيالايدۇ (4-رەسىم).

4-رەسىم ، فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار ئۇسۇلى ئارقىلىق بايقالغان FRQ قىممىتى NGS تەجرىبىسىدە ئېرىشكەن ئۈنۈملۈك سانلىق مەلۇماتلار بىلەن ناھايىتى يۇقىرى باغلىنىشلىق (R2> 0.9).قىزىل سىزىق بولسا 0.2 ng / uL (log10 = -0.7) گە تەڭ كېلىدىغان FRQ قىممىتى.【4】

FFPE ئەۋرىشكىسىگە قوللىنىلغاندىن باشقا ، ھەقىقىي مىقداردىكى PCR ئۇسۇلىمۇ ئەۋرىشكەدىكى چەكلىگۈچنى ئۈنۈملۈك نازارەت قىلالايدۇ.بىز بايقىلىدىغان ئەۋرىشكىنى ئىچكى ئاكتىپ كونترول (IPC) ۋە ئۇنىڭ Assay ئارقىلىق ئىنكاس سىستېمىسىغا قوشالايمىز ، ئاندىن فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدارلاشتۇرۇپ Ct قىممىتىگە ئېرىشەلەيمىز.ئەگەر Ct قىممىتى ئەۋرىشكە بولمىغان رېئاكسىيەدە Ct قىممىتىدىن ئارقىدا قالسا ، بۇ چەكلىگۈچىنىڭ ئەۋرىشكىدە بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ھەمدە ئىنكاستىكى كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى چەكلەيدۇ.

05 كۇبىت فلۇئورېسسېن بوياش ئۇسۇلى

كۇبىت فلورومېتىر يادرو كىسلاتاسىنىڭ قويۇقلۇقى ۋە ساپلىقىنى تەكشۈرۈشتە ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان كىچىك ئۈسكۈنە بولۇپ ، مەشغۇلات قىلىش ئاسان ۋە ھەر بىر مولېكۇلا بىئولوگىيە تەجرىبىخانىسىدا دېگۈدەك مەۋجۇت.ئۇ يادرو كىسلاتاسىنىڭ قويۇقلۇقىنى بايقاش ۋە يادرو كىسلاتاسىنى باغلاش فلۇئورېسسېن بوياق (Qubit بايقاش رېئاكتورى) ئارقىلىق توغرا ھېسابلايدۇ.Qubit نىڭ سەزگۈرلۈكى ۋە ئېنىقلىقى يۇقىرى بولۇپ ، RNA نى pg / µL قويۇقلۇقىغىچە توغرا مىقدارلاشتۇرالايدۇ.تېرمو فىشېرنىڭ ئەڭ يېڭى يېڭى مودېلى Qubit 4.0 نى يادرو كىسلاتاسىنىڭ قويۇقلۇقىنى توغرا مىقدارلاشتۇرۇش ئىقتىدارىغا ئىگە بولغاندىن باشقا ، RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنىمۇ بايقىيالايدۇ.Qubit 4.0′s RNA تەكشۈرۈش سىستېمىسى (RNA IQ Assay) بىرلا ۋاقىتتا ئىككى خىل فلۇئورېسسېنسىيە بوياقنى بايقاش ئارقىلىق RNA نىڭ مۇكەممەللىكىنى بايقىيالايدۇ.بۇ ئىككى خىل فلۇئورېسسېنسىيە بوياق ئايرىم-ئايرىم ھالدا چوڭ پارچىلار ۋە RNA نىڭ كىچىك پارچىلىرىنى باغلىيالايدۇ.بۇ ئىككى خىل فلۇئورېسسېنسىيە بوياق ئەۋرىشكىسىدىكى RNA نىڭ چوڭ پارچىلىرىنىڭ نىسبىتىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇنىڭدىن RNA سۈپىتىگە ۋەكىللىك قىلىدىغان IQ (سەمىمىيەت ۋە سۈپەت) قىممىتىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.IQ قىممىتى FFPE ۋە FFPE بولمىغان ئەۋرىشكىلەرگە ماس كېلىدۇ ، كېيىنكى تەرتىپ سۈپىتىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ.NGS تەجرىبىسىنى مىسالغا ئالساق ، Ion torrent ™ سۇپىسىدا ئېلىپ بېرىلغان RNA-Seq سىناق تەجرىبىسىدە ، IQ قىممىتى 4 دىن يۇقىرى ئەۋرىشكىلەرنىڭ كۆپىنچىسىدە كەم دېگەندە% 50 ئۈنۈملۈك ئوقۇشلۇق بار (5-رەسىم).يۇقىرىدا تىلغا ئېلىنغان بايقاش ئۇسۇللىرىغا سېلىشتۇرغاندا ، Qubit IQ Assay مەشغۇلات قىلىشقا قۇلايلىق بولۇپلا قالماي ، يەنە ئاز ۋاقىت كېتىدۇ (بەش مىنۇت ئىچىدە) ، ئەمما ئۆلچەملىك پارامېتىر IQ قىممىتى بىلەن تۆۋەنكى ئېقىن تەجرىبىسىنىڭ سانلىق مەلۇمات سۈپىتى ئوتتۇرىسىدا ناھايىتى چوڭ باغلىنىش بار.

5-رەسىمدە ، Qubit RNA IQ قىممىتى بىلەن RNA-Seq نىڭ خەرىتە ئوقۇلۇشى ئوتتۇرىسىدا ناھايىتى چوڭ باغلىنىش بار.【5】

يۇقارقى تونۇشتۇرۇش ئارقىلىق ، مەن كۆپچىلىكنىڭ ئوخشىمىغان RNA سۈپىتىنى كونترول قىلىش ئۇسۇللىرىنى يېتەرلىك چۈشىنىدىغانلىقىغا ئىشىنىمەن.ئەمەلىيەتتە ، سىز تاللىيالايسىزئەۋرىشكە تىپى ۋە مەۋجۇت قوراللارغا ئاساسەن مۇناسىپ ئۇسۇل.RNA سۈپىتىنى ياخشى كونترول قىلغاندىلا ، ئاندىن ئەۋرىشكە سۈپىتىنىڭ ناچارلىقىدىن كېلىپ چىققان كېيىنكى سىناقلارنىڭ مەغلۇبىيىتىدىن ساقلىنالايمىز ، شۇڭا قىممەتلىك ۋاقىت ، ئېنېرگىيە ۋە تەننەرخنى تېجەپ قالالايمىز.

پايدىلىنىش مەھسۇلاتلىرى:

ھايۋانلارنىڭ ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى

ھۈجەيرە ئومۇمىي RNA ئايرىمىسى

پايدىلانما

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA ئۆلچەشتە سەمىمىيەت قىممىتىنى تەقسىملەش ئۈچۈن RNA مۇكەممەللىك نومۇرى.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org / 10.1186 / 1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine ئىنسانلارنىڭ ئىممۇنىتېت repertuary ئىشلەتكۈچى قوللانمىسى (نەشرى MAN0017438 Rev. C.0).

.https://doi.org/10.1093/toxsci/